《Journal of Food Protection》：Understanding prevalence of
Listeria using 16S rRNA-based sequencing of culture enrichments and structural equation modeling within food processing environments
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食品加工环境中的表面微生物群（surface microbiota）是考察病原体流行率和潜在食品安全风险时需要考虑的重要因素。本研究考察了12个州48家食品生产企业的微生物多样性和Listeria流行率，涵盖四种不同的加工环境：Seafood（n=20）、Da
食品加工环境中的表面微生物群（surface microbiota）是考察病原体流行率和潜在食品安全风险时需要考虑的重要因素。本研究考察了12个州48家食品生产企业的微生物多样性和Listeria流行率，涵盖四种不同的加工环境：Seafood（n=20）、Dairy（n=16）、Produce（n=8）和Ready-to-Eat food（RTE，n=4）。研究人员利用环境拭子培养富集物的16S rRNA扩增子测序，分析了1,068份样品，以表征微生物群和Listeria流行率。微生物类群随企业类型和采样位置而变化，优势属包括Enterococcus、Pseudomonas、Lactococcus和Listeria。Listeria阳性细菌群落表现出比非阳性群落更低的alpha多样性（alpha diversity）。应用结构方程模型（Structural Equation Modeling, SEM）研究生物杀灭剂（biocides）使用、Listeria流行率和微生物多样性之间的关系。Seafood和Dairy等行业使用具有较高pH评分的生物杀灭剂，与较低的Listeria流行率相关。通过对众多变量进行统计分析，本研究表明16S rRNA序列数据如何通过结构方程模型（SEM）来理解Listeria流行率和群落对生物杀灭剂使用等安全措施的反应，从而为不同食品生产环境中的食品安全提供信息。
论文解读：
研究背景与问题：食品加工环境表面微生物群是影响病原体流行和食品安全风险的重要因素。FDA（U.S. Food and Drug Administration）持续推进基因组学方法和信息学工具以现代化食品安全措施，核心目标之一是预防病原体在食品生产环境中藏匿。食品污染风险随商品类型、地理位置和安全措施而变化。Listeria（李斯特菌属）在Produce、即食食品（Ready-to-Eat, RTE）、Dairy和Seafood企业中受到关注，可在多种表面存活并在冷藏温度下生长，造成显著经济负担。病原体藏匿可发生于难以充分清洁的区域，生物膜可保护细菌免受热、干燥、氯和抗菌剂影响。环境监测“Zone Concept”将操作区分为Zone 1至Zone 4，Zone 1为食品接触表面，风险最高。测序数据有助于识别食品生产环境中的细菌。先前研究多基于培养病原体分离，对生物杀灭剂（biocides）使用如何影响微生物群落动态及Listeria持续存在缺乏全面理解。因此，研究人员利用16S rRNA扩增子测序和结构方程模型（SEM）研究食品商品、加工环境、采样区域、生物杀灭剂使用、微生物群落组成与Listeria流行率之间的关系。
研究开展与意义：研究人员对12个州48家食品企业的四种加工环境进行分析：Seafood（n=20）、Dairy（n=16）、Produce（n=8）和RTE（n=4），共1,068份环境拭子培养富集物进行16S rRNA测序，并应用SEM。研究显示微生物类群随企业类型和采样位置变化；Listeria阳性群落alpha多样性较低；生物杀灭剂强度、行业类型和采样区域与Listeria流行率及微生物多样性相关。该研究为利用16S rRNA序列数据和SEM理解不同食品生产环境中的Listeria流行率及群落对消毒措施的反应提供了框架。
关键技术方法：样本来自2018年2月至2021年7月FDA监管工作完成后收集的12个州48家食品生产企业的1,068份环境拭子培养富集物。培养检测按FDA Bacteriological Analytical Manual（BAM）第10章进行。研究人员提取细菌沉淀DNA，构建16S rRNA基因扩增子文库，并在20个Illumina MiSeq runs中测序。序列经FLASH合并、USEARCH质控和去嵌合，MAPSeq进行分类。以98% identity聚类操作分类单元（Operational Taxonomic Units, OTUs），计算alpha和beta多样性，使用ANOVA、ADONIS、Kruskal Wallis和FDR校正。采用SEM（R lavaan包，diagonally weighted least squares，probit链接）分析行业类型、中层级采样区（Mid-Tier Zone, MTZ）、生物杀灭剂评分、Listeria流行率和Shannon多样性指数（Shannon diversity index, SDI）。
研究结果：
Microbial profile analysis（微生物谱分析）：对48家企业环境拭子培养富集物进行16S rRNA测序，优势属包括Enterococcus、Pseudomonas、Lactococcus和Listeria。Carnobacterium在Seafood和RTE企业中更常见。Dairy企业中Lactococcus样本数较多，相对丰度达7%，而Seafood企业平均为1%。Produce和RTE企业中Lactococcus相对丰度也高于Seafood。不同覆盖食品产品（Food Products Covered, FPC）企业具有独特微生物谱。Pairwise ADONIS显示，Seafood企业微生物多样性显著高于Produce（p=0.007），Dairy企业显著低于Produce（p=0.006）、Seafood（p=0.0008）和RTE（p=0.006）。
Listeria detection using metagenomics（基于宏基因组的Listeria检测）：为减少假阳性，研究人员采用1%相对丰度阈值，Listeria丰度≥0.99%视为测序阳性，<0.99%视为阴性。对1,068份样品分析显示，16S rRNA测序与培养结果相比，总体敏感性为55.22%，特异性为98.81%。
Firm level analysis（企业层面分析）：48家企业中16家有多次检查或采样日期。Firm I和Firm L元数据最全面，被选进一步分析。Firm I为Dairy企业，生产冰淇淋、冰淇淋棒、冰淇淋三明治和水果味冰等，3次采样，使用不同区域特异性生物杀灭剂，n=61，用于研究不同区域及区域特异性生物杀灭剂使用下总微生物多样性和Listeria流行率变化。
Bacterial fingerprint and diversity analysis of Seafood Firm L（Seafood Firm L细菌指纹与多样性分析）：Firm L主要加工Seafood，也生产甜点、混合渔/海产品和Katsuoboshi（bonito或skipjack tuna烘烤干燥后用作调味剂）。Firm L在2018至2021年间4轮检查，n=43；前3轮n=27有元数据，用于构建平面图并映射不同空间和环境监测区。2018年2月和2021年6月拭子Listeria阴性，2018年10月和2020年12月培养和16S测序阳性。27份拭子来自kitchen（n=7）、salad room（n=7）、slicing room（n=1）、packing room（n=6）和storage room（n=6）。不同房间微生物指纹独特。salad room Listeria阳性最多（n=3），培养和测序均阳性。slicing room以Carnobacterium为优势。kitchen是唯一检出Meiothermus属的房间，相对丰度<1%。第二次检查未在slicing room采样，可能解释该次无Carnobacterium。主坐标分析（Principal Component Analysis, PCA）显示不同MTZ微生物多样性存在差异，kitchen与salad room差异显著（p=0.00018），salad room多样性更高。
Structural equation modeling（结构方程模型）：culture、16S和diversity模型CFI均为1.0，RMSEA均为0，拟合良好。高危行业（Dairy和Produce）生物杀灭剂pH评分更低、强度更强的假设得到支持；Seafood和RTE生物杀灭剂较弱，评分较高。Produce企业Listeria流行率显著低于RTE企业，culture标准化回归系数=-0.09，p<0.10；16S=-0.2，p<0.001。仅16S结果中，Dairy流行率显著高于Produce（0.08，p<0.10），显著低于RTE（-0.09，p<0.05）；Produce低于Seafood（-0.09，p<0.01）和RTE（-0.2，p<0.001）；Seafood低于RTE（-0.08，p<0.10）。行业风险排序建议由高到低为RTE、Dairy、Seafood、Produce。SDI方面，Dairy高于Produce（0.1，p<0.001）和RTE（0.07，p<0.05），Produce低于Seafood（-0.06，p<0.05）。强生物杀灭剂对应较低Listeria流行率，culture为-0.08，p<0.10；16S为-0.1，p<0.001；对应较高SDI（0.1，p<0.001）。MTZ距食品越远，Listeria培养流行率越高（0.2，p<0.001），多样性越高（0.3，p<0.001）。最远MTZ的Listeria 16S流行率最高。Listeria培养阳性样品平均SDI显著高于阴性样品（1.44，95% CI：1.38，1.49；0.93，95% CI：0.89，0.97）。在至少50份样品（5%）中出现的属中，与Listeria共富集概率最高的为Pseudomonas、Enterococcus、Carnobacterium、Lactococcus和Staphylococcus。
讨论与结论：讨论指出，研究主要目标为Listeria检测并理解其流行率与生物杀灭剂、原料和产品类型的关系。16S rRNA测序结合SEM可明确指定并评估预测因子与结局之间的假设关系，估计效应大小，比较行业类型、生物杀灭剂和区域等因素的相对强度。富集条件虽选择性利于Listeria，也允许其他微生物生长。16S测序敏感性仅55.22%，但特异性高至98%，主要因富集样品中16S rRNA测序局限及严格1%阈值。仅靶向16S rRNA基因两个高变区V1-V3可能不足以识别目标类群。先前shotgun quasi-metagenomic研究可准确将MAGs置于同一SNP簇，但本研究16S数据仍支持分析细菌群落和共发生微生物。共发生属包括Pseudomonas、Enterococcus、Lactococcus等，与混合物种生物膜研究一致。不同区域独特细菌群落有助于识别潜在藏匿点和追踪Listeria转移。Firm L的kitchen、salad room、slicing room和packing room差异可能由各房间原料驱动。多次采样企业Firm I和Firm L的群落变化依赖采样位置及生物杀灭剂类型和频率，说明食品企业微生物群落高度动态，尤其靠近食品区域。Listeria常被分离并可能持续存在，消毒方法可塑造微生物组并形成生物膜。局限包括元数据缺失，约50%样品缺区域信息，近75%缺区域或生物杀灭剂数据。对295份缺生物杀灭剂元数据样品进行加权均值插补；488份缺MTZ样品因拭子特异性无法插补，敏感性分析后保留并赋值4.5，因包含可改善模型拟合，且其中82%为培养阴性。最终1,051份完整数据用于培养和16S分析；16S识别Listeria阳性样品多于培养阳性（41.6% vs. 28.9%）；1,051份16S数据用于SDI。SEM显示区域和生物杀灭剂效应量最高。行业风险显著影响Listeria流行率和alpha多样性，是中心驱动因子；生物杀灭剂强度与alpha多样性正相关；16S检测与行业类型关系强于培养。研究结论翻译：研究人员已证明，基于富集物的16S rRNA测序结合结构方程模型（SEM）的应用，有助于理解这些企业中的微生物指纹、Listeria流行率以及不同食品企业中使用的生物杀灭剂的影响。
