Nisin对Bacillus cereus芽孢的促萌发-抑出长活性、机制及熟牛肉应用

《Journal of Food Protection》：Nisin Against Bacillus cereus Spores: Activity, Characterization, and Beef Application

　　

耐热产芽孢细菌是即食（ready-to-eat, RTE）食品腐败的主要原因，有效控制芽孢污染对食品保藏至关重要。Nisin是一种公认安全（Generally Recognized As Safe, GRAS）的抗菌肽，对产芽孢细菌具有强活性，但其在芽孢萌发和出长阶段的具体作用仍不清楚。研究人员从腐败熟牛肉中鉴定出耐热Bacillus为优势腐败菌，并选择B. cereus通过表型和转录组分析评价Nisin的抑制作用。Nisin对B. cereus芽孢的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）为400 μg/mL。Nisin轻微促进芽孢萌发，但显著抑制萌发后芽孢的后续出长。时间杀菌试验显示，1 MIC Nisin在6 h将活菌数降至3.09 log CFU/mL，而对照组为8.05 log CFU/mL；2 MIC处理2 h对完整芽孢实现0.65-log降低，但对萌发芽孢实现1.49-log降低。Nisin破坏膜通透性和完整性，触发胞内氧化应激，导致基因组DNA损伤并降低三磷酸腺苷（ATP）合成。转录组分析揭示3049个差异表达基因，能量代谢和氨基酸生物合成途径受到扰动。在熟牛肉中，Nisin有效抑制B. cereus出长并延缓贮藏期间产品腐败。该研究为应用Nisin控制产芽孢细菌和延长即食肉制品货架期提供了实际数据支持。

论文主体解读

研究背景方面，牛肉因营养优越和质构良好而受消费者青睐，中国作为新兴牛肉市场，人均牛肉消费持续增长。肉制品营养丰富，易发生微生物腐败，导致质构劣变和异味，加工与贮藏中的微生物污染还会造成食源性疾病并缩短货架期。准确识别食品中的特定腐败微生物，有助于开发更具针对性的抗菌控制策略。既往研究中，Lactobacillus、Bacillus、Pseudomonas和Leuconostoc等被鉴定为熟肉制品相关优势腐败菌，但具体菌株分布受加工方式、贮藏温度和包装条件影响。对于热处理产品，耐热微生物可存活于热加工过程，随后产生腐败代谢物和毒素。Bacillus可形成内生孢子，耐受热加工并在加工肉制品中持续存在。已有报道显示，从腐败熟香肠分离的6株腐败微生物均属于Bacillus；中国肉制品中B. cereus总体检出率为26.37%，牛肉产品中为22.58%，加工肉中检出率显著高于生肉。随着生活水平提高，合成化学防腐剂难以满足公众对健康膳食的需求，天然来源抗菌剂因低刺激和高安全性受到关注。Nisin是由Lactococcus lactis产生的天然细菌素，已被美国食品药品监督管理局授予GRAS地位，对多数革兰阳性菌具有强抑制活性。然而，Nisin对Bacillus spp.芽孢抗菌活性的系统研究仍相对有限。因此，研究人员旨在研究Nisin对Bacillus芽孢的抑制效果，并结合细菌表型试验与转录组分析阐明其潜在机制。

研究人员开展了菌株分离鉴定、致病性与腐败特性评价、Nisin抑菌活性与机制分析以及熟牛肉应用研究。结论表明，Nisin对B. cereus芽孢具有明显抗芽孢活性，其特点为轻微促进芽孢萌发，但显著抑制萌发后出长；该作用与膜损伤、氧化应激、能量代谢扰动、蛋白质利用受影响和DNA损伤相关，并在熟牛肉中有效抑制B. cereus出长、延缓腐败。该研究为Nisin控制芽孢形成菌污染和延长即食肉制品货架期提供了数据支持。

关键技术方法概括不超过250字：研究人员从西安某超市采集两包腐败膨胀熟牛肉样品分离菌株，并以购自American Type Culture Collection的B. cereus ATCC14579为模型。关键技术包括16S rDNA测序与系统发育分析、小鼠致病性试验、腐败酶和溶血活性检测、100 °C热耐受比较；测定MIC与亚抑菌浓度（sub-inhibitory concentration, SIC），开展生长曲线、时间杀菌、OD₆₀₀监测萌发与出长、芽孢染色、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）、核酸和蛋白泄漏、NPN摄取、碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色、膜电位、活性氧（reactive oxygen species, ROS）、ATP、SDS-PAGE和DNA损伤分析；进行Nisin热稳定性测试和RNA-Seq转录组分析；在熟牛肉中接种芽孢并检测菌落计数、pH和外观。

研究结果如下。

菌株分离与鉴定：对腐败即食牛肉进行菌落计数和细菌分离，两个样品总活菌数分别为7.19和5.52 log CFU/g。从每个样品平板随机选取3个形态不同菌落纯化，16S rDNA测序显示，1-1、1-3和2-3与Bacillus subtilis聚类，2-1与Bacillus amyloliquefaciens聚类，1-2和2-2与B. cereus聚类。

分离株致病性、产腐败酶能力与耐热性评价：小鼠感染试验显示，与B. cereus聚类的1-1和1-2致病性显著强于其他Bacillus。所有供试Bacillus均产生蛋白水解和脂解活性；1-2和2-2无淀粉水解活性，但在血平板上表现溶血活性。100 °C热处理下，1-1和1-3营养细胞分别在20 min和30 min低于检测限，而芽孢在60 min后仍保持高存活数。

Nisin对Bacillus芽孢的抑制作用：Nisin对B. cereus ATCC14579及6株分离株营养细胞和芽孢的MIC为200–400 μg/mL。研究人员选择B. cereus ATCC14579芽孢作为后续机制研究模型。1 MIC和2 MIC Nisin完全抑制LB broth中芽孢生长，低于1/8 MIC时与对照无显著抑制差异，因此将低于1/8 MIC定义为SIC。时间杀菌曲线显示，1/2 MIC降低总活菌数生长速率，但6 h时与未处理组无显著差异；1 MIC和2 MIC处理的总菌数分别为3.09和2.82 log CFU/mL，显著低于对照的8.05 log CFU/mL；1 MIC和2 MIC处理2 h后芽孢数较对照显著降低。

Nisin促进芽孢萌发但抑制后续出长：通过监测芽孢悬液OD₆₀₀变化和显微镜观察评价。Nisin处理以剂量依赖方式增强初始20 min内OD₆₀₀下降，1 MIC和2 MIC组吸光度下降显著大于对照，表明Nisin促进芽孢萌发。20 min后对照组吸光度开始上升，反映出长开始；60 min后1/2 MIC组吸光度开始上升，而1 MIC和2 MIC组无上升趋势，表明高浓度Nisin阻断后续出长。光学显微镜和SEM显示，对照组芽孢被染红并在2 h后萌发为表面光滑的规则杆状细胞；随Nisin浓度增加，红色杆状细胞比例逐渐降低，SEM观察到皱缩和破裂的芽孢结构，2 MIC组最明显。结果表明，Nisin促进芽孢萌发但剂量依赖地显著抑制后续出长，1 MIC可完全抑制出长。

Nisin在芽孢萌发和出长过程中破坏内膜完整性：通过胞内核酸和蛋白泄漏、NPN摄取、膜电位和PI染色评价。Nisin处理后，胞外核酸浓度随浓度升高逐渐增加，胞外蛋白也呈剂量依赖增加；NPN摄取随Nisin浓度升高逐渐增加，但1 MIC和2 MIC之间无显著差异。膜电位检测显示，Nisin处理后胞内荧光强度显著增加，表明细胞膜去极化，且2 MIC荧光强度显著高于1 MIC。PI染色显示，1 MIC和2 MIC处理组红色荧光较对照显著增加。结果表明，Nisin处理损害芽孢萌发和出长期间内膜完整性与通透性，导致膜功能丧失。

Nisin在芽孢萌发和出长过程中诱导氧化应激和能量耗竭：测定胞内ROS和ATP浓度。对照组ROS水平持续较低，Nisin处理后胞内ROS水平以剂量依赖方式显著升高，表明Nisin诱导氧化应激。对照组胞内ATP浓度为1.54 ± 0.09 μM，1/2 MIC Nisin处理显著降低至0.41 ± 0.08 μM，且随Nisin浓度升高ATP水平进一步下降，表明发生严重能量耗竭。结果表明，Nisin诱导氧化应激和能量耗竭，从而促进对芽孢出长的抑制。

Nisin在芽孢萌发和出长过程中影响蛋白质合成并导致DNA损伤：SDS-PAGE分析显示，Nisin处理组与对照组蛋白条带数量无显著差异，但1 MIC和2 MIC处理芽孢中低分子量蛋白条带（<10 kDa）染色强于对照，提示低分子量蛋白利用受抑制并积累。基因组DNA琼脂糖凝胶电泳显示，未处理芽孢DNA条带尖锐且强；Nisin处理芽孢DNA条带荧光强度减弱，并随Nisin浓度增加出现渐进拖尾，表明DNA断裂和降解。结果表明，Nisin处理影响蛋白合成并损害DNA完整性，进一步促进芽孢失活。

Nisin对B. cereus芽孢、萌发芽孢和营养细胞的灭活效果：在PBS中分别处理芽孢、萌发芽孢和营养细胞。2 MIC Nisin处理2 h后，存活芽孢仅降低0.65 log CFU/mL；萌发后芽孢菌落数降低1.49 log CFU/mL；1/2 MIC处理营养细胞2 h后总菌数低于检测限。结果表明，Nisin对芽孢形式的B. cereus杀菌效果有限，营养细胞最敏感，萌发芽孢次之。

Nisin的耐热性评价：Nisin在100 °C处理30和60 min后，对B. cereus ATCC14579芽孢的MIC仍为400 μg/mL；温度提高至121 °C处理30 s后MIC亦不变。结果表明，Nisin具有良好热稳定性。

转录组分析揭示Nisin诱导的蛋白质合成、能量代谢和应激反应扰动：RNA-Seq成功注释5479个已知基因。对照与Nisin处理组比较，鉴定出3049个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），其中1579个上调、1470个下调。下调DEGs的基因本体（Gene Ontology, GO）富集显示，生物学过程主要包括翻译、基因表达、细胞过程、大分子代谢、肽和酰胺代谢与生物合成以及初级代谢；细胞组分富集于细胞质、无膜细胞器、核糖体和核糖核蛋白复合物；分子功能富集于核糖体结构活性、RNA结合及多种催化与转移酶活性，提示细菌蛋白质合成受强抑制。上调DEGs的GO富集显示，生物学过程主要包括α-氨基酸代谢与生物合成、L-精氨酸合成和芽孢萌发；分子功能富集于NADH脱氢酶、泛醌还原酶和非氨酰基酰基转移酶活性，提示细菌对Nisin胁迫的适应性代谢反应，但补偿不足以恢复细胞稳态。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析显示，下调DEGs主要富集于细胞运动、双组分信号转导和碳水化合物代谢，包括鞭毛组装、细菌趋化和磷酸戊糖途径；上调DEGs主要富集于中心代谢、次级代谢物生物合成、β-内酰胺耐药、微生物环境适应和群体感应。总体表明，Nisin显著扰动蛋白质合成、能量代谢、细胞运动和信号转导，同时激活部分应激和适应代谢途径，与膜损伤、氧化应激、能量耗竭和蛋白合成受损等表型一致。

Nisin抑制熟牛肉中的芽孢：熟牛肉营养丰富，易腐败。对照组芽孢快速萌发并进入对数生长期，12 h菌落数达8.54 log CFU/g并进入稳定期。Nisin处理后B. cereus生长延迟；1 MIC、2 MIC和4 MIC处理组12 h总活菌数分别为7.59、7.04和3.86 log CFU/g，显著低于对照。pH检测显示，Nisin可延缓B. cereus降解牛肉蛋白引起的pH升高。外观观察显示，未处理对照和1 MIC Nisin处理组熟牛肉明显腐败，表现为质软和色暗；4 MIC Nisin处理组外观无显著变化。结果表明，Nisin在熟牛肉中有效抑制B. cereus芽孢出长并延缓产品腐败。

讨论部分总结：Bacillus可形成高度耐热的内生孢子，能存活食品加工，对熟食构成潜在威胁。B. cereus是常见食源病原，可引起食品腐败并产生肠毒素或催吐毒素cereulide，导致食物中毒。中国调查显示，B. cereus在牛肉中检出率为22.58%，加工肉制品污染率41.94%，高于生肉制品24.58%。本研究中从熟牛肉分离的菌株均属于Bacillus，均产蛋白酶，B. cereus致病性更强。芽孢可在高温、低pH、高压等不良条件下存活，条件适宜后萌发为代谢活跃的营养细胞，因此抑制芽孢向营养细胞转变十分必要。Nisin对Bacillus芽孢MIC为200–400 μg/mL，低于中国熟肉制品最大允许水平0.50 g/kg（GB 2760-2024），并显著抑制熟牛肉中B. cereus芽孢。与苯乳酸（MIC 1.25 mg/mL）和百里酚（对Alicyclobacillus acidoterrestris芽孢MIC 0.5 mg/mL）相比，Nisin对Bacillus芽孢更强。Nisin热稳定性好，100 °C处理60 min或121 °C处理30 s后MIC不变，适合预制肉加工。局限包括食品基质因素如pH、盐和蛋白相互作用，以及非靶向扩散可能需更高剂量；未来研究可关注微胶囊提高稳定性并在工业条件下验证。时间杀菌中总菌与芽孢数量差异表明，Nisin可有效杀死代谢活跃的营养细胞，但不能完全灭活芽孢；这与萌发后Clostridium difficile芽孢比休眠芽孢更敏感的研究一致。PBS中休眠芽孢、萌发芽孢和营养细胞敏感性不同，营养细胞杀菌效果最高，萌发芽孢次之，休眠芽孢最耐受。芽孢萌发时核心复水并释放吡啶二羧酸（dipicolinic acid, DPA），导致悬液浊度下降，随后出长并伸长成典型长杆状。本研究中Nisin加速萌发，但强抑制萌发后出长，显微镜和SEM支持该结论。细胞膜在芽孢萌发和出长中既是保护屏障，也是信号转导、运输、能量代谢和物质交换中心，其完整性和通透性对成功萌发和出长至关重要。过量ROS可造成DNA、蛋白和膜脂氧化损伤。本研究中Nisin剂量依赖升高胞内ROS。稳定膜电位对维持呼吸链、ATP合成和底物运输重要，膜损伤后质子泄漏和电荷失衡导致去极化。ATP是驱动能量转导、大分子生物合成和分泌代谢的主要能量货币，对芽孢萌发和出长必需，本研究中Nisin处理显著降低胞内ATP。储存蛋白水解为小肽和游离氨基酸，为出长提供氮和能量；SDS-PAGE显示低分子量物质积累但未被消耗，说明不能有效支持出长。DNA电泳显示主带位移、强度减弱和剂量依赖拖尾，表明基因组DNA发生凝聚和断裂；有研究提示Nisin不直接结合细菌DNA，DNA损伤可归因于膜损伤触发ROS介导氧化应激的间接作用。转录组进一步支持：上调DEGs富集于芽孢萌发、氨基酸代谢和生物合成途径；下调DEGs富集于双组分系统、鞭毛组装、细菌趋化、磷酸戊糖途径和半乳糖代谢，这些通路对出长、运动、能量代谢和环境适应重要，因而萌发芽孢无法正常出长。Nisin可被人体消化酶降解，在食品安全和生物相容性方面具有优势。总体而言，Nisin通过诱导芽孢萌发并抑制后续出长，减轻即食牛肉中B. cereus芽孢风险，支持其作为热稳定、安全、高效天然防腐剂用于控制芽孢污染并提高即食肉制品微生物安全性。研究主要在实验室条件下进行，未来需在实际工业加工和贮藏条件及复杂肉食品基质中评价其实际抗菌效果，并探索Nisin与其他栅栏技术联合以实现更强芽孢抑制。

研究结论翻译：总之，本研究证实耐热产芽孢细菌是腐败熟牛肉中的优势腐败菌，并证明Nisin对B. cereus具有抗芽孢活性：轻微加速芽孢萌发，同时有效抑制萌发后芽孢的后续出长。生理和转录组分析表明，该活性与出长细胞膜损伤、ROS介导的氧化应激以及能量代谢受扰有关。这些发现为应用Nisin控制芽孢污染并提高即食肉制品微生物安全性提供了实验支持。