辐射诱导CCR2+单核细胞AXL上调促进心脏纤维化

《Clinical and Translational Medicine》：Radiation-induced AXL upregulation in CCR2+ monocytes promotes cardiac fibrosis

背景：胸部放疗可导致迟发性心脏纤维化，但将放射损伤与成纤维细胞活化联系起来的免疫机制仍不清楚。研究人员研究了CCR2+单核细胞是否参与辐射诱导的心脏纤维化，以及AXL是否调控其成纤维细胞活化活性。 方法与材料：C57BL/6小鼠接受20 Gy全胸照射，从IR_D0至IR_D60评估重构情况。批量RNA测序与单细胞数据集、CIBERSORTx反卷积、谱系示踪和组织染色相结合。通过CCR2中和评估CCR2+单核细胞功能，并通过流式细胞术定量循环CCR2+Ly6Chi单核细胞。使用诱导性髓系Axl敲除和贝美替尼（R428）研究AXL。通过转录组学分析和分选的CCR2+Ly6Chi单核细胞免疫印迹评估MAPK信号传导。将Axl缺失、R428抑制AXL或U0126抑制MEK1/2后分选单核细胞的条件培养基应用于心脏成纤维细胞。 结果：心脏纤维化在IR_D30时已确立，而白细胞浸润和凋亡信号仍高于基线水平。转录组学分析和谱系示踪显示心脏中CCR2+单核细胞积聚增加。CCR2中和减少了循环CCR2+Ly6Chi单核细胞，并减弱了间质胶原沉积和纤维化标志物表达。Axl在CCR2+单核细胞区室中富集。髓系Axl缺失和R428均减少了心脏纤维化。Axl缺失抑制了MAPK相关转录程序，而遗传或药理学AXL靶向降低了分选单核细胞中MEK和ERK的磷酸化。来自IR_D30单核细胞的条件培养基诱导成纤维细胞中COL1A1和α-SMA表达，而供体单核细胞的Axl缺失、R428或U0126处理减弱了这一效应。 结论：AXL信号传导通过至少部分依赖于MEK/ERK信号传导的机制，参与照射后心脏CCR2+单核细胞的成纤维细胞活化旁分泌活性。

辐射诱导心脏纤维化中CCR2⁺单核细胞AXL–MEK/ERK信号轴的作用机制解读

一、研究背景与科学问题

放疗是胸部及纵隔恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分，但心脏不可避免地受到照射后，可在治疗后数年出现心血管毒性。流行病学数据显示，乳腺癌幸存者中，平均心脏剂量每增加1 Gy，主要冠脉事件发生率即增加7.4%，且该风险在放疗后5年内即开始显现，并持续升高至少二十年。辐射诱导的心脏疾病涵盖缺血性心脏病、心包疾病、瓣膜病变、传导异常及心肌病等多种形式，其中纤维化重构是心脏照射后最主要的病理反应之一。进行性间质基质沉积增加心肌僵硬度，破坏心脏结构与功能，但将放射损伤与持续性纤维化联系起来的细胞学机制仍不完全清楚。

活化成纤维细胞是心脏纤维化中主要的基质产生细胞，但其行为受损伤实质细胞、血管细胞及免疫细胞信号的调控。T细胞、B细胞、中性粒细胞、驻留巨噬细胞及浸润单核细胞均可影响成纤维细胞活化，其贡献因损伤原因和阶段而异。近年研究在人类心力衰竭中鉴定出CCR2⁺单核细胞/巨噬细胞与疾病相关成纤维细胞之间的空间组织化相互作用，单细胞研究也开始描绘辐射相关心脏巨噬细胞状态的变化。然而，单纯照射后特定单核细胞群体是否在功能上促进纤维化，尤其是在从早期损伤向确立的纤维化重构转变的过程中，仍不清楚。

CCR2⁺单核细胞是介导这一转变的合理候选群体。CCL2–CCR2轴信号控制炎性单核细胞的动员和组织进入，这些细胞可分化成巨噬细胞并释放改变邻近基质细胞的介质。在心肌梗死及其他急性心脏损伤中，这些细胞参与炎症清除和瘢痕形成，但延长或失调的单核细胞活性也可促进不良重构。急性缺血性损伤后的修复性瘢痕形成并不等同于心脏照射后发生的进行性间质纤维化，因此仍需确定CCR2⁺单核细胞是否在功能上促进辐射诱导的心脏纤维化，而不仅仅是作为炎症反应的一部分积聚。

AXL是TYRO3–AXL–MERTK受体酪氨酸激酶家族成员，调控细胞存活、胞葬作用、迁移及组织损伤后的炎症适应。GAS6–AXL信号已在肝脏、肺及其他器官的纤维化重构中被证实，在肝星状细胞、成纤维细胞、内皮细胞及髓系群体中均有报道活性。在心脏中，晚期心力衰竭患者心肌AXL表达和循环可溶性AXL升高，实验性压力超负荷在心室重构早期诱导Axl表达。髓系AXL还可促进心肌缺血再灌注损伤后的适应不良性炎症。近期肺纤维化研究进一步提示AXL可调控Ly6C^hi单核细胞中的促纤维化程序，但照射心脏中是否存在类似机制仍属未知。这些研究将AXL置于纤维化与炎症重构的交叉点，同时表明其功能不限于单核细胞。尚未解决的问题是：照射后心脏重构过程中AXL是否在CCR2⁺单核细胞中被诱导并具有功能活性，以及其是否调控这些细胞促进成纤维细胞活化的能力。

基于上述背景，研究人员开展本研究，旨在阐明炎性髓系反应如何与全胸照射后心脏纤维化的发展相偶联。

二、主要技术方法

研究人员采用多层面整合策略。动物模型方面，使用C57BL/6J小鼠接受单次20 Gy全胸照射建立辐射诱导心脏纤维化模型；使用Lyz2^CreERT2; Rosa26^tdTomato小鼠进行髓系谱系示踪，使用Lyz2^CreERT2; Axl^fl/fl; Rosa26^tdTomato小鼠实现他莫昔芬诱导的髓系特异性Axl条件敲除。转录组层面，对IR_D0、IR_D7、IR_D30心脏组织进行批量RNA测序，并整合公共辐射相关心脏单细胞RNA测序数据集（PRJNA1088304，含d0、d7、d35样本）及AngII诱导心脏重构参考数据集（E-MTAB-8810）；使用CIBERSORTx进行细胞类型反卷积。功能验证层面，采用抗CCR2中和抗体减少循环单核细胞、R428（贝美替尼）药理学抑制AXL、U0126抑制MEK1/2；通过流式分选获取心脏CCR2⁺Ly6C^hi单核细胞进行免疫印迹信号分析及条件培养基-原代心脏成纤维细胞共培养实验。组织学评估涵盖Masson三色染色、天狼星红染色、免疫组织化学及多重免疫荧光。

三、研究结果

3.1 辐射建立具有持续性炎症和纤维化的过渡性心脏微环境

Masson三色和天狼星红染色显示，IR_D7心脏间质胶原沉积有限，IR_D30显著增加并持续至IR_D60。Collagen I和α-SMA染色遵循相同时间模式。CD45阳性细胞比例在IR_D30仍显著高于Sham，cleaved caspase-3和TUNEL阳性在IR_D7达峰后于IR_D30下降但仍高于基线。IR_D30因此代表持续性炎症与确立的纤维化共存的时间窗口。

3.2 CCR2⁺单核细胞在辐射诱导心脏纤维化重构中积聚

CIBERSORTx反卷积显示IR_D30时成纤维细胞比例增加，单核吞噬细胞系统（MPS）增加最为显著。公共单细胞数据集中，单核细胞群以Ly6c2、Ms4a4c、Lgals3、Ccr2表达为特征，其相对丰度在d35较d0和d7显著增加。谱系示踪证实IR_D30时RFP阳性细胞比例及其中CCR2⁺RFP⁺细胞比例均显著高于IR_D7。

3.3 CCR2中和减弱辐射诱导的心脏纤维化

抗CCR2抗体处理显著减少循环CCR2⁺Ly6C^hi单核细胞，IR_D30时间质和血管周围胶原沉积、Collagen I及α-SMA阳性面积均显著降低，证实CCR2⁺单核细胞的功能贡献。

3.4 AXL在辐射诱导心脏重构期间于CCR2⁺单核细胞中上调

IR_D30与IR_D0、IR_D30与IR_D7比较中排名前10的显著上调基因交集鉴定出Ccr2、Axl、Fn1、Thbs1四个共享基因。单细胞数据中Axl表达主要限于MPS区室且以单核细胞最显著，d35高于d0和d7。免疫荧光证实IR_D30时CCR2阳性群体中AXL⁺CCR2⁺细胞比例升高。GAS6阳性细胞比例和蛋白水平在IR_D30升高，参考数据集中Gas6主要在成纤维细胞和内皮细胞表达。

3.5 髓系Axl缺失和药理学AXL抑制减弱辐射诱导的心脏纤维化

髓系Axl条件敲除后，分选单核细胞中AXL蛋白检测不到。Axl-cKO心脏中Acta2、Col1a1、Col3a1 mRNA水平显著降低，间质和血管周围胶原沉积及Collagen I、α-SMA阳性面积减少。R428处理（IR_D7至IR_D30，25 mg/kg每日口服）重现了Axl-cKO的抗纤维化表型。

3.6 遗传和药理学AXL靶向抑制照射后心脏CCR2⁺Ly6C^hi单核细胞中的MAPK信号

Axl-cKO心脏转录组中Map2k1、Map2k2、Dusp9差异表达，KEGG分析显示MAPK信号是Axl-cKO中下调基因富集最显著的途径，GSEA证实MAPK基因集负富集。免疫印迹显示Axl缺失和R428处理均降低分选单核细胞中pMEK/MEK和pERK/ERK比值，总MEK和ERK丰度无显著变化。

3.7 心脏CCR2⁺Ly6C^hi单核细胞中的AXL–MEK/ERK信号促进旁分泌成纤维细胞活化

IR_D30单核细胞条件培养基较Sham显著增加成纤维细胞COL1A1和α-SMA表达，Axl-cKO供体细胞条件培养基的效应显著减弱。R428离体处理IR_D30单核细胞降低pAXL、pMEK、pERK水平，其条件培养基诱导成纤维细胞COL1A1和α-SMA的能力减弱。U0126处理降低MEK和ERK磷酸化而不影响pAXL/AXL比值，其条件培养基同样减弱成纤维细胞活化反应。

四、讨论与结论

讨论部分指出，IR_D30代表免疫细胞改变与确立的纤维化环境共存的重构阶段，支持免疫重构与纤维化基质扩展并行发生的观点。CCR2⁺单核细胞提供了连接这些重叠反应的细胞学途径。AXL在CCR2⁺单核细胞区室中的功能贡献得到髓系Axl缺失和药理学抑制双重验证。转录组和信号分析将AXL与MEK/ERK磷酸化水平偶联，条件培养基实验确立AXL依赖的旁分泌成纤维细胞活化效应。研究局限性包括：Lyz2^CreERT2模型靶向更广泛的髓系谱系而非仅单核细胞；公共数据集d35与IR_D30不完全对应；单次20 Gy照射模型与临床分次照射存在差异；未评估心脏功能结局和人类放疗相关心脏标本。

结论：IR_D30代表在确立的纤维化心脏环境中持续性免疫细胞改变的特征阶段。在此背景下，心脏CCR2⁺单核细胞中的AXL信号通过至少部分依赖MEK/ERK信号传导的机制促进其成纤维细胞活化能力。这些发现将照射诱导的心脏CCR2⁺单核细胞变化与成纤维细胞活化联系起来，支持进一步评估AXL作为辐射诱导心脏纤维化潜在治疗靶点。