靶向拓扑异构酶II的新型噻唑并[3,2-a]嘧啶衍生物的设计、合成及生物活性评价

《Journal of Molecular Structure》：Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Thiazolo[3,2- a]pyrimidine Derivatives as Potential Anticancer Agents Targeting Topoisomerase II

• 设计并合成了一系列新颖的噻唑并[3,2-a]嘧啶衍生物。• 化合物1对肿瘤细胞表现出最高的抗增殖活性。• 化合物3a、8b和9a选择性抑制拓扑异构酶II。• 先导化合物对WI-38细胞表现出选择性并诱导DNA损伤。• 化合物3a在A549细胞中诱导G1期阻滞和8倍凋亡。

引言

癌症仍然是全球最普遍和最致命的疾病之一，对健康和生存构成重大挑战。挑战在于难以鉴定出能阻碍肿瘤细胞增殖同时又不损伤正常细胞的全新选择性药物[1], [2], [3]。全球癌症观察站（GLOBOCAN 2022）估计，2022年全球共有2000万新发癌症病例和970万例癌症相关死亡；预计到2050年，这些数字将超过每年3500万新发病例[4]。乳腺癌和肺癌在全球疾病负担中占据不成比例的份额，这归因于其流行病学规模、分子复杂性和治疗困难。

乳腺癌目前是全球女性最常见的疾病，截至2022年，新增近230万诊断病例和超过66万死亡病例，是全球女性癌症相关死亡的主要原因[4,5]。肺癌仍然是两性癌症死亡的首要原因，估计每年约180万人死亡，超过乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌死亡人数之和[4,6]。尽管靶向治疗和免疫治疗取得了重大突破，晚期乳腺（约29%）和肺（约6-8%）恶性肿瘤的五年生存率仍然令人沮丧[7]，这凸显了更加有效的治疗方法的持续未满足需求。

DNA拓扑异构酶是关键的核酶，在复制、转录、重组和染色体分离过程中，通过催化DNA链的瞬时断裂、通过和重新连接来控制DNA的拓扑状态[8]。拓扑异构酶分为结构和机制上截然不同的两类：I型（Topo-I），引入瞬时的单链DNA断裂；和II型（Topo-II），产生瞬时的酶桥连双链DNA断裂，以允许完整的双链通过断裂段，该过程需要ATP水解[[9], [10], [11], [12], [13]]。Topo-II在广泛的恶性肿瘤中明显过表达，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌和结直肠癌，其高表达与高肿瘤分级、淋巴结受累和不良总预后相关[14,15]。已鉴定出两大类Topo-II抑制剂：(i) Topo-II毒药（界面抑制剂），它们稳定瞬时的Topo-II DNA共价切割复合物，将酶转化为内源性DNA损伤剂并激活凋亡细胞死亡通路；和(ii) 催化抑制剂，它们抑制Topo-II活性的切割复合物稳定以外的步骤，包括抑制DNA结合、ATP酶活性或重新连接，而不引起DNA链断裂[16,17]。Topo-II毒药为多种临床批准的细胞毒药物提供了分子基础，包括蒽环类药物（多柔比星I、柔红霉素、表柔比星）、鬼臼毒素类（依托泊苷II、替尼泊苷）、蒽醌类（米托蒽醌III）和萘啶类（高三尖杉酯碱IV）[18]（图1）。催化抑制剂，如ICRF-187（地塞米松），因其能够避免与切割复合物稳定药物相关的遗传毒性毒性谱而备受关注[19]。治疗靶向Topo-II具有令人信服的理由，有以下几个原因。与静止的正常组织相比，该酶在活跃增殖的肿瘤细胞中特别过表达，提供了内在的治疗窗口[14]。在转化细胞中诱导的Topo-II介导的DNA链断裂，由于DNA损伤检查点信号传导缺陷，导致不可逆凋亡，这是恶性细胞的特征[20]。Topo-II过表达导致侵袭性乳腺癌和肺癌的染色体不稳定性，抑制它会影响DNA复制和有丝分裂效率[21]。已建立的Topo-II毒药在临床上有效，但其使用受到严重副作用的限制，如心脏毒性、继发性白血病、骨髓抑制、脱发和多药耐药性[22,23]。这些挑战推动了研究朝着新的杂环化合物方向发展，这些化合物可以选择性抑制Topo-II，并针对耐药癌症具有更好的安全性和有效性。

噻唑并[3,2-a]嘧啶核是一个受青睐的嘌呤生物电子等排体支架，在抗癌药物开发中引起了持续的兴趣[24]。该支架由两个独立生物活性的杂环——噻唑和嘧啶——通过化学融合形成，将能够嵌入DNA碱基对之间的平面富电子芳香表面与合成可操作的变异位点相结合[25,26]。越来越多的研究将噻唑并[3,2-a]嘧啶鉴定为DNA结合的抗肿瘤药和有效的Topo-II抑制剂。Hassan等人发现取代的噻唑并[3,2-a]嘧啶V结合双链DNA并抑制Topo-II，其效力可与多柔比星相当[26]。Nemr及其同事随后报道了抑制Topo-II、阻滞细胞周期和引发凋亡的噻唑并嘧啶及稠合嘧啶三环噻唑并嘧啶衍生物VI、VII[27,28]。最近，萘[2′,3′:4,5]噻唑并[3,2-a]嘧啶杂合体VIII被证明作为Topo-II/EGFR双重抑制剂，其细胞毒性超过多柔比星和厄洛替尼[29]。这一趋势延续到当前文献中，新公开的噻唑并嘧啶-3-酮系列IX显示出单位数微摩尔的Topo-II抑制活性[30,31]（图2）。这些证据汇聚成一个一致的图景：噻唑并嘧啶模拟了临床先导化合物的机制行为——嵌入、诱导凋亡的Topo-II毒害，同时通常表现出比多柔比星更高的肿瘤选择性和比笨重的糖基化依托泊苷和蒽环类药物药效团更有利的类药性特征。因此，该支架代表了一个合理的结构平台，可以在其上重建和优化经验证的Topo-II抑制药效团要求。

基于依托泊苷和多柔比星记录的结合模式[32,33]以及我们之前报道的先导化合物X[25]图2，占据Topo-II活性位点所需的基本药效团要素[34]可总结为如下：(1) 扁平、延展的多芳族生色团，嵌入切割位点的DNA碱基对之间并与氨基酸残基进行π-π堆积，这是稳定三元酶-DNA-抑制剂复合物所需的主要锚定点。(2) 氢键供体/受体基团（如乙基羧酸酯羰基和酰胺NH/C=O基团），定位形成与催化口袋残基的方向性氢键。(3) 连接在嵌入核心对侧的沟结合侧链，类似于多柔比星的氨基糖和依托泊苷的三氧化悬垂苯基，插入DNA小沟以提供额外的结合稳定性和选择性。(4) 可质子化的碱性氮，能在生理pH下产生阳离子中心，推动与多聚阴离子DNA磷酸骨架的静电吸引并支持与酸性残基的离子接触。(5) 适当尺寸的连接臂（酰胺、亚甲基或脲基），正确定位和定向生色团相对于沟结合基团。(6) 悬垂芳环上的脂溶性和/或吸电子外围取代基（卤素、三氟甲基、腈基），增强结合亲和力、调节选择性并改善细胞渗透性。这些互补特征的保留和优化——平面嵌入剂、氢键锚定、沟结合剂、可阳离子化中心和平衡的脂溶性包络——构成了指导本工作的设计模式。

在我们之前的噻唑并[3,2-a]嘧啶系列研究基础上，其中三氯苯甲酰胺衍生物X通过强效Topo-II抑制、优越的抗增殖活性、增强的相对多柔比星的选择性和诱导凋亡的特性而成为先导化合物[25]，我们寻求通过加强DNA嵌入药效团来进一步增强Topo-II亲和力。因此，多柔比星、依托泊苷和化合物X被共同采用为先导结构，设计三个新的衍生物系列（A-C系列）（图3）。核心设计假设是将双环噻唑并嘧啶的平面共轭芳香表面扩展为刚性的三环体系（支架扩展策略）将加深嵌入并增强切割复合物内的π堆积[32]。因此，一个额外的六元环被稠合到噻唑并嘧啶核心上，提供了两个稠合三环类似物：嘧啶并-噻唑并嘧啶（B系列），通过稠合嘧啶环生成并带有可变桥头杂原子（X? = NH, O, S）来调节支架的电子和氢键性质。吡啶并-噻唑并嘧啶（C系列），通过稠合吡啶环生成，并在稠合环上引入H、Cl或CN取代基。这些取代基被选用来研究吸电子基团对Topo-II亲和力和生物活性的影响，基于我们之前的发现，化合物X中的三氯基团显著增强了效力[25]。在所有系列中，经验证的药效团要素——乙基羧酸酯、碱性环氮和平面芳香——被保留。同时，母体的2,4-二甲氧基苯基基团被萘基取代基取代，萘基是一个平面双环芳香支架，进一步增大了嵌入和脂溶性表面，并已在萘并稠合噻唑并嘧啶Topo-II抑制剂中证明有价值[29]。一个互补的亚苄基系列（A系列），带有单甲氧基或三甲氧基苄基取代基（X? = 4-OCH?或3,4,5-(OCH?)?），被设计来研究甲氧基取代对生物活性的影响，符合我们之前的构效关系发现[25,26]。

化学部分摘要

噻唑并[3,2-a]嘧啶衍生物1, 2和3a,b-9a,b按照方案1和方案2所述合成。在这些化合物中，乙基6-甲基-4-(萘-1-基)-2-硫代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸酯(1)已在文献中报道[35]，在本研究中按照之前报道的合成程序制备[25]。其余十五个衍生物是在本工作中全新合成的。通过以下方法确认了化合物形成：

结论

本研究成功制备了一系列16个噻唑并[3,2-a]嘧啶基杂环衍生物，包括15个新合成的化合物和1个已报道的衍生物(1)，并评估了其对A549和MCF-7癌症细胞系的细胞毒活性。生物评估表明，噻唑并[3,2-a]嘧啶支架的结构修饰影响了合成衍生物的细胞毒活性。化合物1被确认为具有最强的活性

化学部分

所有化学品和试剂均购自Aldrich（Sigma-Aldrich），未经进一步纯化直接使用。反应通过薄层色谱法（TLC）监控，在含有GF/254的硅胶玻璃板上进行，并通过紫外光或碘指示剂显色。红外光谱在岛津IR 435分光光度计（KBr，cm?1）上测定。1H-NMR和13C-NMR光谱分别在布鲁克400 MHz和100 MHz分光光度计上测定，以TMS作为内标。化学位移(δ)

作者声明

我们确认与本文出版物没有已知的利益冲突，也没有可能影响其结果的重大财务支持。

我们确认手稿已被所有署名作者阅读和批准，没有其他符合作者资格标准但未列出的人员。我们进一步确认手稿中列出的作者顺序已获我们所有人的批准。

我们确认我们

资金支持

本研究由沙特阿拉伯利雅得诺拉公主宾特·阿卜杜勒阿齐兹大学研究人员支持项目（编号PNURSP2026R95）资助，诺拉公主宾特·阿卜杜勒阿齐兹大学。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可在文章及其补充信息文件中获得。

CRediT作者贡献声明

Eman A. Sobh：撰写 – 原稿，方法论，概念化。Samiha A. El-Sebaey：撰写 – 审阅与编辑，验证。Hanan A. AL-Ghulikah：验证，监督，软件。Mona S. El-Zoghbi：撰写 – 原稿，监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所报道的工作。

致谢

作者感谢沙特阿拉伯利雅得诺拉公主宾特·阿卜杜勒阿齐兹大学研究人员支持项目（编号PNURSP2026R95），诺拉公主宾特·阿卜杜勒阿齐兹大学。

Eman A. Sobh | Samiha A. El-Sebaey | Hanan A. AL-Ghulikah | Mona S. El-Zoghbi