《Aging Cell》：DNMT1 Regulates Testosterone Synthesis in Aged Rat Leydig Cells via FTO-Mediated HSP90AA1 m6A Levels
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# 摘要翻译
睾酮水平自三十岁起随年龄增长而进行性下降，损害精子发生并促成年龄相关疾病，凸显了增强内源性睾酮产生的重要性。DNA甲基转移酶1（DNMT1）可促进Leydig细胞（LCs）中睾酮的合成，但其潜在机制尚不明确。本研究发现，DNMT1表达在衰老大鼠
# 摘要翻译
睾酮水平自三十岁起随年龄增长而进行性下降，损害精子发生并促成年龄相关疾病，凸显了增强内源性睾酮产生的重要性。DNA甲基转移酶1（DNMT1）可促进Leydig细胞（LCs）中睾酮的合成，但其潜在机制尚不明确。本研究发现，DNMT1表达在衰老大鼠睾丸及体外衰老LCs中下调，且与睾酮水平降低相关。功能获得与功能丧失实验证实，DNMT1正性调控睾酮合成并缓解LC衰老；DNMT1过表达可逆转衰老表型并恢复睾酮产生。机制层面，对DNMT1敲低LCs进行RNA-seq鉴定出FTO为下游靶点；DNMT1通过促进Fto启动子甲基化来抑制FTO表达。catRAPID预测及RIP-qPCR验证了Hsp90aa1 mRNA是FTO的直接底物；FTO通过m6A修饰调控HSP90AA1表达，而DNMT1通过FTO间接调节HSP90AA1。研究人员利用HSP90AA1过表达、药理抑制及拯救实验，证实DNMT1–FTO轴通过HSP90AA1介导的AKT激活抑制LC凋亡，从而促进睾酮合成。该轴在衰老大鼠睾丸及衰老LCs中的表达模式进一步佐证了其参与年龄相关睾酮失调。体内AAV介导的睾丸DNMT1敲低重现了上述发现。综上，本研究阐明了DNMT1在年龄相关睾酮下降中的生理功能，揭示了DNMT1调控LC衰老及类固醇生成功能的机制，为生殖系统衰老提供了潜在治疗靶点。
# 论文解读文章
## 一、研究背景与科学问题
睾酮是维持雄性生殖功能的核心激素，不仅支持精子发生，还参与调控多种全身生理过程。流行病学与临床研究显示，男性血清睾酮水平自30岁左右达到峰值后随年龄增长呈进行性下降趋势，这种下降与免疫功能障碍、骨密度降低、心血管疾病及睡眠障碍等年龄相关疾病密切相关。目前临床广泛应用的睾酮替代疗法（TRT）虽可部分缓解症状，但存在疗效有限及红细胞增多症、心血管事件、前列腺相关病变等明显不良反应与禁忌证。因此，深入解析年龄相关睾酮下降的分子机制，寻找增强内源性睾酮合成的干预靶点，对于延缓男性生殖衰老具有重要意义。
表观遗传改变是衰老的重要标志之一，其中DNA甲基化是最稳定且研究最深入的表观遗传修饰形式。DNA甲基转移酶1（DNMT1）是维持基因组甲基化稳态的关键酶，其表达失调与生殖障碍及衰老表型密切相关。研究显示，DNMT1在睾丸中较其他31种人体组织表达更为丰富，提示其可能是调控睾丸功能的核心甲基转移酶。然而，DNMT1调控Leydig细胞（LCs）睾酮合成的具体分子机制此前尚不清楚。另一方面，N6-甲基腺苷（m6A）作为最主要的一种RNA转录后修饰，在哺乳动物精子发生及生殖功能维持中发挥重要调控作用。FTO作为特征明确的m6A去甲基化酶，已被发现在衰老小鼠多种器官中表达显著上调，提示其广泛参与机体衰老过程。但DNA甲基化与m6A修饰之间的交互作用（表观遗传crosstalk）在生殖衰老背景下鲜有研究。基于此，研究人员提出假设：DNMT1可能通过DNMT1–FTO表观遗传交互作用，调控衰老LCs中下游靶基因表达，进而影响年龄相关睾酮下降。
## 二、研究设计与技术方法
研究人员以不同月龄（2、6、12、18月龄）的Wistar大鼠作为体内衰老模型，并分离培养原代大鼠LCs建立体外衰老模型，通过一系列分子生物学实验阐明DNMT1调控睾酮合成的机制。所用样本队列包括：40只雄性Wistar大鼠分为4个年龄组，每组10只；用于体内基因敲低实验的AAV9介导的睾丸局部注射模型；以及从 postnatal Day 15–20、2月龄和18月龄大鼠分离的原代LCs。
主要关键技术方法包括：（1）免疫组织化学、Western blot、RT-qPCR检测DNMT1、FTO、HSP90AA1及类固醇合成酶表达；（2）甲基化特异性PCR（MSP）和染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）检测Fto启动子甲基化水平及DNMT1结合；（3）RNA-seq比较DNMT1敲低LCs的转录组差异；（4）MeRIP-qPCR检测Hsp90aa1 mRNA的m6A修饰水平；（5）RIP-qPCR验证FTO蛋白与Hsp90aa1 mRNA的直接相互作用；（6）慢病毒介导的基因敲低与过表达、17-AAG药物抑制、SA-β-gal染色、TUNEL凋亡检测等。
## 三、主要研究结果
**3.1 衰老大鼠睾丸及体外衰老Leydig细胞中DNMT1与睾酮的表达变化**
研究人员通过纵向检测不同月龄大鼠睾丸组织发现，DNMT酶活性、血清睾酮水平及类固醇合成酶CYP11A1、CYP17A1、StAR的表达均呈年龄依赖性下降。体外培养的原代LCs经连续传代建立衰老模型后，同样表现出睾酮分泌减少、DNMT1表达下调及衰老标志物p16和SASP因子升高。体内外结果一致表明衰老伴随DNMT1表达和睾酮合成的同步下降。
**3.2 DNMT1正性调控Leydig细胞睾酮合成与细胞衰老**
功能获得与功能丧失实验显示，DNMT1敲低显著降低培养上清中睾酮水平，抑制CYP11A1、CYP17A1和StAR蛋白表达，同时增加SA-β-gal阳性细胞比例并上调p16及SASP因子表达；反之，DNMT1过表达在衰老LCs中逆转衰老表型并恢复睾酮分泌。这些结果证实DNMT1不仅是睾酮合成的正调控因子，也抑制LC衰老程序。
**3.3 DNMT1通过启动子甲基化抑制FTO表达以调控睾酮合成**
RNA-seq分析鉴定出m6A去甲基化酶FTO为DNMT1敲低后显著上调的靶基因。MSP和ChIP-qPCR证实DNMT1直接结合Fto启动子CpG岛并维持其高甲基化状态。DNMT1敲低降低Fto启动子甲基化并上调FTO表达，DNMT1过表达则相反。双敲低实验表明，同时敲低FTO可显著逆转DNMT1缺失导致的睾酮合成下降和类固醇合成酶下调，且FTO过表达不影响DNMT1表达，证明DNMT1→FTO调控方向是单向的。
**3.4 FTO通过m6A修饰调节HSP90AA1表达，DNMT1经FTO间接调控HSP90AA1**
catRAPID预测结合RIP-qPCR验证了Hsp90aa1 mRNA是FTO的直接结合底物。FTO过表达降低全细胞m6A水平和Hsp90aa1转录本特异性m6A修饰水平，同时下调HSP90AA1表达；FTO敲低则相反。DNMT1敲低虽不改变Hsp90aa1启动子DNA甲基化水平，但显著降低HSP90AA1表达，且FTO敲低可拯救此效应，证明DNMT1通过FTO间接调控HSP90AA1，而非直接作用。
**3.5 DNMT1–FTO轴经HSP90AA1介导的AKT信号抑制Leydig细胞凋亡并促进睾酮合成**
HSP90AA1过表达提高睾酮产生和类固醇合成酶表达，并显著增加p-AKT和抗凋亡蛋白BCL-2、降低促凋亡蛋白BAX；17-AAG药理抑制则相反。HSP90AA1表达改变不影响DNMT1或FTO水平，表明其位于调控轴下游。系列拯救实验（DNMT1/FTO双敲低、FTO/HSP90AA1共过表达、FTO敲低加17-AAG处理）及TUNEL凋亡染色在多层次上确立了DNMT1–FTO–HSP90AA1–AKT线性级联信号轴对LC凋亡和睾酮合成的层级调控关系。
**3.6 衰老过程中FTO–HSP90AA1–AKT轴的异常改变**
18月龄大鼠睾丸及体外衰老LCs中均观察到Fto启动子低甲基化、FTO表达上调、Hsp90aa1 mRNA m6A修饰水平降低、HSP90AA1表达下调、p-AKT和BCL-2减少及BAX升高伴随凋亡细胞增多。从2月和18月龄大鼠分离的原代LCs验证了相同趋势，确证该调控轴在生理性衰老过程中异常激活。
**3.7 体内DNMT1敲低验证DNMT1–FTO–HSP90AA1–AKT轴的调控作用**
研究人员通过AAV9介导的睾丸局部注射实现体内DNMT1特异敲低。与对照相比，AAV-DNMT1组血清睾酮显著降低，CYP11A1、CYP17A1、StAR表达下调，Fto启动子甲基化减少，FTO表达升高而HSP90AA1降低，凋亡细胞增多，p-AKT和BCL-2下降、BAX升高。此外，体内DNMT1敲低还诱发了LC衰老表型，表现为SA-β-gal阳性细胞增多、SASP因子和p16表达上调。
## 四、讨论与结论
本研究系统阐明了DNMT1-FTO-HSP90AA1-AKT这一全新调控轴在年龄相关睾酮下降中的作用机制。在衰老LCs中，DNMT1表达减少一方面直接促进LC衰老，另一方面导致Fto启动子低甲基化，去抑制FTO转录和蛋白表达。升高的FTO作为m6A去甲基化酶，降低Hsp90aa1转录本的m6A修饰水平，进而抑制HSP90AA1表达。HSP90AA1下调削弱AKT磷酸化及下游抗凋亡信号（BCL-2降低、BAX升高），最终促进LC凋亡并导致睾酮合成减少。该轴为增强内源性睾酮合成提供了可干预的药理靶点，DNMT1和m6A修饰因子的选择性小分子抑制剂有望用于缓解男性生殖衰老。
研究结论翻译：DNMT1驱动Fto启动子DNA甲基化从而抑制FTO表达，FTO表达下调进而通过限制FTO介导的Hsp90aa1转录本m6A去甲基化来维持HSP90AA1表达。升高的HSP90AA1随后激活AKT信号通路，抑制Leydig细胞凋亡，最终促进睾酮生成。综上，本研究将DNMT1–FTO–HSP90AA1–AKT轴认定为衰老过程中增强内源性睾酮合成的潜在治疗靶点。
