慢性瘙痒治疗靶点MRGPRX4配体调控构象可塑性的结构洞察

《Cell Discovery》：Structural insights into the ligand modulation of MRGPRX4 conformational plasticity

　　

慢性瘙痒是一种令人痛苦的疾病，治疗选择有限，尤其在胆汁淤积性肝病中，胆汁酸失调是已知触发因素。虽然Mas-related G蛋白偶联受体X4（MRGPRX4）近期被确认为胆汁酸诱导瘙痒的关键介质，但其抑制的结构机制仍知之甚少，阻碍了治疗性拮抗剂开发。研究人员报道了MRGPRX4三种状态的冷冻电镜（cryo-EM）结构：激动剂结合态、拮抗剂结合态和载脂蛋白（apo）态。研究揭示此前未认识的拮抗剂结合位点，在结构上不同于激动剂所占据位点。互补功能 assay 和分子动力学（MD）模拟进一步表明，MRGPRX4胞外口袋在结合激动剂与拮抗剂时发生显著配体依赖性构象重排。这些发现阐明了MRGPRX4活性调控下的构象可塑性，并为靶向慢性瘙痒的MRGPRX4拮抗剂理性设计提供了结构框架。

论文《Structural insights into the ligand modulation of MRGPRX4 conformational plasticity》发表于《Cell Discovery》。研究背景方面，慢性瘙痒（chronic pruritus）持续超过6周，严重损害患者生活质量，全球约22%人群一生中曾经历；胆汁淤积性肝病中胆汁酸代谢障碍使血浆胆汁酸升高，胆汁酸与胆红素可激活背根神经节（DRG）神经元上的Mas-related G蛋白偶联受体X4（MRGPRX4），诱发胆汁淤积性瘙痒。MRGPRX4是非典型A类G蛋白偶联受体（GPCR），缺乏CWxP、PIF、DRY等保守基序及经典钠结合位点，基础活性高；既往仅有激动剂结合结构，拮抗剂结合结构缺失，限制抗痒药物开发。因此，研究人员开展MRGPRX4不同功能态高分辨率结构解析与机制研究。

关键技术方法上，研究人员使用S83变异体MRGPRX4与工程化核苷酸交换缺陷miniG_sq、Gβ1γ2、scFv16共表达形成预偶联复合物；以地塞米松磷酸酯（DEX-P）为激动剂、cmpd54-4为拮抗剂、无配体为apo态，利用冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析获三种态结构并做跨膜区局部精修；采用Tango（β- arrestin招募报告基因assay）、BRET1 miniG_sq招募assay评价药理；用丙氨酸点突变验证残基功能；以分子动力学（MD）模拟分析胞外环动态与残基重定位。

研究结果如下。Cryo-EM structures of MRGPRX4–miniG_sq complexes in three states：研究人员解析激动剂态2.97 ?、拮抗剂态2.98 ?、apo态2.89 ?的MRGPRX4–miniG_sqβ1γ2–scFv16结构，局部精修后明晰跨膜螺旋与配体密度，证实受体高基础活性下可与G蛋白预偶联。Recognition of the agonist DEX-P in MRGPRX4：DEX-P磷酸基与R82^2.60、R86^2.64、R95^3.25正电腔盐桥结合，甾核与K96^3.26、W158^4.61、Y240^ECL3、Y250^7.31、Y254^7.35疏水接触；点突变削弱或消除激动活性，说明酸性基团加甾骨架构象是MRGPRX4激活关键。Distinct binding mode of the antagonist cmpd54-4：cmpd54-4呈L形居于TM3–TM7疏水袋，分R1–R3区；R1羧基碰S100^3.30、烷基碰K96^3.26，R2碰V99^3.29、F232^6.51、Y254^7.35、M258^7.39，R3碰V181^5.44、Y240^ECL3并与T103^3.33氢键；F232^6.51或Y254^7.35突变消除反向激动作用，结构优化未获更强活性但给出构效关系（SAR）框架。Antagonistic mechanism of cmpd54-4：cmpd54-4位点在DEX-P结合态不可入；W158^4.61向外旋向膜，腾出拮抗亚袋；ECL3中E247^7.28转向正构口袋，以羧基模拟磷酸与R82/R86/R95正电腔作用，空间阻塞激动剂位点，故拮抗靠胞外重排而非同口袋竞争。Ligand-specific conformational rearrangement in MRGPRX4：apo态中W158^4.61似拮抗态、E247^7.28似激动态；MD显示无DEX-P时W158^4.61自发外移，配体结合驱动胞外环可塑性，受体具多态转换能力。Conformational variations in the G protein coupled to MRGPRX4 across three states：虽同偶联miniG_sq，Y106^3.36–G229^6.48氢键距、PIF疏水堆积、CWxP位置及Gα5/αN螺旋在三相态渐变，说明胞外配体可变构微调胞内G蛋白界面。

讨论部分总结：研究人员指出MRGPRX4拮抗结构空白被填补；apo态下ECL2在外、激动剂使其内插，cmpd54-4占ECL2内插区从而阻其内移；E247^7.28重定位封闭正电亚袋，这类大尺度拮抗诱导重排在A类GPCR中少见；S83与L83多态中cmpd54-4位点远离83位，拮抗药效不受多态影响；cmpd54-4拓扑位类比MRGPRX1/X2/D的激动剂位，凸显MRGPR家族配体识别多样；局限为工程miniG_sq与预偶联中间态非完全非活态。

研究结论部分翻译：MRGPRX4是胆汁酸关键受体，参与胆汁淤积性瘙痒；本研究的三种功能态高分辨冷冻电镜结构经功能assay、SAR与MD验证。既往激动剂结合使ECL2插入正构口袋，W158^4.61为激动效必需；apo态ECL2在袋外，cmpd54-4通过占据激动态ECL2区阻止其内移。cmpd54-4不直接塞住激动剂位点，而是使E247^7.28从膜侧转向正构口袋，与R82^2.60、R86^2.64、R95^3.25形成盐桥封闭磷酸结合处。此类拮抗诱导重排于A类GPCR罕见。S83为人群主变异，cmpd54-4对S83/L83抑制相当，靶向此袋可避多态差异。MRGPRX4拮抗位点拓扑同其他MRGPR激动位点，示家族识别可变。研究受限工程miniG_sq与中间态。综上，研究给出MRGPRX4配体识别与构象动力框架，为胆汁淤积性瘙痒新药设计提供不可替代结构依据。