整合转录组与蛋白质组揭示运输应激下荷斯坦牛肉品质及相关调控因子

《Food Science & Nutrition》：Integrating Transcriptomic and Proteome Analysis to Understand Muscle Qualities and Related Regulatory Factors of Holstein Beef Under Transportation Stress

本研究旨在探讨运输应激对牛肉品质及相关调控机制的影响。12头体重相近的荷斯坦阉牛被分为运输15 h组（STR）和运输0 h组（CON）。比较运输应激牛肉与正常牛肉在肉品质、肌原纤维结构和风味成分方面的差异。通过对腰最长肌（longissimus lumborum）转录组和蛋白质组的综合分析，鉴定肉中与运输应激相关的基因和蛋白质。研究发现，STR组牛肉的剪切力、失水率和滴水损失显著高于CON组（p ≤ 0.05），STR组牛肉大理石纹等级显著低于CON组（p = 0.035）；肌肉透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）检查发现，运输显著缩短肌节长度。此外，长途运输对肌肉风味产生不利影响。研究人员发现，6个差异表达基因/差异表达蛋白（differentially expressed genes/differentially expressed proteins, DEGs/DEPs）在mRNA和蛋白质表达中呈现相同趋势。运输应激可能至少部分通过铁死亡（ferroptosis）通路介导的脂质过氧化影响牛肉品质和风味。同时，观察到的应激响应基因/蛋白（HMOX1和BDH1）变化与伴随的肉品质相关基因/蛋白（COL1A1、FMOD和MYL3）变化相关联，表明这些分子事件可能共同促进品质劣变。研究人员的这些结果为运输应激对牛肉品质的影响提供了重要见解。

运输应激是畜牧生产中常见且难以避免的宰前应激因素。奶牛公犊在部分国家是牛肉的重要来源，欧盟、美国、荷兰等均有较高比例牛肉来自奶公牛；但奶公牛产肉性能通常低于专用肉牛，适当育肥可提升肉品质和产量。现代肉牛产业链中，长途运输不可避免，中国每年约5000万头牛被运输至不同地点屠宰，运输期间禁食禁水以减少消化道内容物、污染和便于胴体重评估，但会诱发应激。已有研究多集中在血液生理生化、采食、死亡率、嫩度、pH和肉色等，针对奶公牛牛肉运输应激对品质调控因子的转录组和蛋白质组整合研究较少。宰前应激可导致肌肉糖原消耗、宰后pH异常下降、PSE（pale, soft, exudative）肉、肌原纤维收缩、肌间空隙增大和保水性下降。因此，研究人员希望回答长途运输是否影响肉品质相关调控因子以及如何影响。

研究人员以甘肃华瑞牧场荷斯坦奶公牛为对象，最终选12头体重相似（636.63±47.31 kg）的牛，随机分为运输0 h对照（CON）和运输15 h应激（STR）组，每组6头。STR组经892 km、平均75 km/h、15 h 24 min运输至屠宰场，运输期间禁食禁水，CON组同期也禁食禁水；次日08:00两组在1 h内按相同标准屠宰。采集左侧胴体第10—13肋间腰最长肌（longissimus lumborum, LL），用于肉品质、透射电子显微镜（TEM）、风味、转录组和蛋白质组分析。研究得出，运输应激可损害牛肉品质、肌纤维结构和风味，可能通过铁死亡通路介导的脂质过氧化实现，并与应激响应基因/蛋白HMOX1、BDH1及品质相关基因/蛋白COL1A1、FMOD、MYL3改变相关；这为运输应激影响牛肉品质的分子机制提供重要线索和潜在生物标志物。

关键技术方法概括如下：研究样本来源于甘肃华瑞牧场荷斯坦奶公牛队列，40头中筛选18头单栏饲养，试验第270天选12头（636.63±47.31 kg）随机分为CON和STR，每组6头，STR运输15 h，采集LL。关键技术包括肉品质指标测定、TEM观察肌节长度和肌原纤维直径、气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）分析挥发性风味、Illumina Novaseq转录组测序、Orbitrap Explorer 480质谱DDA/DIA蛋白质组检测、DIA-NN搜库与OPLS-DA判别、qRT-PCR验证DEGs、GO/KEGG富集和PPI网络分析等。

3.1 肉品质和肌纤维组织形态分析（Analysis of Meat Quality and Myofiber Histomorphology）：肉品质测定显示STR组L^*、a^*、b^*显著低于CON（p ≤ 0.01），剪切力、失水率和滴水损失显著升高，大理石纹评分显著降低，蒸煮损失低于CON（p=0.006）。pH值虽有组间显著差异，但CON为5.89、STR为5.52，原文认为可能尚未达到诱导PSE或DFD肉缺陷程度。TEM显示STR组宰后24 h肌原纤维自溶程度高于CON，肌节长度显著短于CON，肌原纤维直径无差异。结论为运输应激改变肌纤维结构并损害保水性。

3.2 挥发性风味化合物分析（Volatile Flavor Compounds Analysis）：GC-IMS检测53种挥发物，鉴定42种，包括酮、醇、醛、酯、呋喃和酸。PCA和三维图显示长途运输应激导致风味化合物显著变化。STR中2,3-丁二酮、乙酸、乙偶姻二聚体/单体、环戊酮、1-丙醇、2,3-丁二醇、3-辛醇单体、乙醇、苯甲醛二聚体/单体、乙酸乙酯二聚体、己醛单体、辛醛二聚体低于CON，而2-己烯醛、丙酮、1-戊醇聚合物、壬醛高于CON。原文认为这些变化可能降低果香、青香和芳香，影响牛肉风味；但未做感官评价。

3.3 转录组和蛋白质组总体统计（Overall Statistics for Transcriptomic and Proteomics Analysis）：转录组原始reads CON为49,320,549、STR为48,101,475，质控后分别46,705,679和43,908,560；共鉴定14,581个基因，其中5976个未知；639个DEGs，STR中174上调、465下调。蛋白质组鉴定2013个蛋白，99个DEPs，48上调、51下调。OPLS-DA可区分两组，置换检验R²Y(cum)=0.99、Q²(cum)=0.964，模型未过拟合。

3.4 DEGs和DEPs的GO和KEGG富集分析（Enrichment Analysis of Differentially Expressed Genes and Proteins in GO and KEGG）：转录水平DEGs显著富集434个GO条目，涉及负调控信号转导、正调控蛋白修饰、细胞死亡调控；细胞器内膜、细胞外基质、线粒体内膜；DNA结合转录因子活性等。蛋白水平富集18个GO条目，涉及循环系统发育、细胞内定位维持、铁离子稳态、胶原纤维组织、过渡金属离子稳态、胞外区域、酶抑制剂活性等。共同富集胶原三聚体（GO:0005581）和酶抑制剂活性（GO:0004857）。KEGG转录水平富集58条通路，以MAPK、人乳头瘤病毒感染、PI3K-Akt为主；蛋白水平富集11条通路，包括铁死亡、单纯疱疹病毒1型感染、胰岛素信号、蛋白消化吸收、补体和凝血级联、JAK-STAT、矿物质吸收，铁死亡、JAK-STAT和矿物质吸收以上调为主。原文认为运输应激激活这些通路，铁死亡和脂质过氧化是关键机制，可产生己烯醛等，影响风味并增加失水。

3.5 转录组和蛋白质组联合分析（Combined Transcriptome and Proteome Analysis）：639个DEGs中563个无对应蛋白，68个对应蛋白非DEP；77个DEPs编码基因非DEG，201个蛋白无对应转录本。8个DEGs/DEPs（BDH1、HMOX1、HSPB1、PFN2、COL1A1、FMOD、MYL3、SLC16A3）在转录和蛋白水平均变化；BDH1、PFN2上调，COL1A1、FMOD、SLC16A3、MYL3下调。PPI中HMOX1和COL1A1为关键节点。HMOX1是氧化应激标志，催化血红素降解产生胆绿素和胆红素，具有抗氧化作用，其上调可能是补偿防御，但血红素降解可负面影响肉色。BDH1为酮解酶，催化乙酰乙酸与3-羟基丁酸互变，上调可能与运输期间饲料限制有关。COL1A1影响胶原合成和嫩度，FMOD参与细胞外基质和胶原原纤维形成，MYL3参与肌原纤维和肌球蛋白发育并与嫩度相关；其下调与肌节缩短、剪切力升高和保水性下降相符。SLC16A3与乳酸和短链脂肪酸转运有关，但与肉品质关系研究有限。总体，运输应激改变氧化应激、酮体代谢、胶原和肌原纤维合成相关基因/蛋白，可能解释品质和风味变化，并可作为潜在生物标志物。

3.6 qRT-PCR验证和相关性分析（Validation of RNA-Seq-Based DEGs Using qRT-PCR and Correlation Analysis）：qRT-PCR检测8个DEGs，表达模式与RNA-seq一致，说明转录组结果可靠。Pearson相关显示BDH1和PFN2与剪切力、滴水损失最强正相关，蛋白-表型相关性更强；COL1A1、FMOD、SLC16A3与剪切力最强负相关、与b^*最强正相关；MYL3与滴水损失和大理石纹等级最强负相关。原文指出未测量运输中温度、湿度、饲养密度等限制，未来需研究长途运输、运输后休息时间、微气候和饲养密度对生理和肉品质的联合影响。

讨论部分总结：运输应激可导致铁离子失衡并激活铁死亡，脂质过氧化影响风味和保水性；JAK-STAT等不能恢复铁稳态；ROS/RNS导致蛋白氧化。HMOX1、BDH1、COL1A1、FMOD、MYL3等有潜力作为运输应激评估标志物。研究局限性包括未测运输微环境和饲养密度等。研究结论翻译如下：本文利用转录组学和蛋白质组学研究运输应激对牛肉品质的影响。运输应激可能通过调节铁死亡通路和脂质过氧化损害牛肉品质、肌纤维结构和风味，数据表明这些效应与应激响应基因/蛋白（HMOX1、BDH1）以及肉品质相关基因/蛋白（COL1A1、FMOD、MYL3）的同步变化相关。研究结果为运输应激对牛肉品质的影响提供了重要见解，可能为研究运输过程中产生的应激提供新平台。