漆树（Rhus coriaria）来源类外泌体纳米颗粒的理化表征与体外生物活性研究

《Chemistry & Biodiversity》：Physicochemical Characterisation and In Vitro Bioactivity of Sumac (Rhus coriaria)-Derived Exosome-Like Nanoparticles

植物来源类外泌体纳米颗粒（plant-derived exosome-like nanoparticles, PELNs）因其天然来源和天然组分而在生物医学研究中引起日益广泛的关注。本研究从漆树（Rhus coriaria）中分离PELNs，并评估其理化性质及体外生物活性。采用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）、纳米颗粒追踪分析（nanoparticle-tracking analysis, NTA）和流式细胞术对分离所得PELNs进行表征；采用气相色谱-质谱联用（GC–MS）分析其化学成分。在A549、HepG2、MCF-7和PC-3肿瘤细胞以及正常人成纤维细胞（hFib）中，从增殖、凋亡和细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）方面评估其生物学效应。PELNs在A549、HepG2、MCF-7和PC-3细胞中的IC50值分别为55.96、50.0、26.0和49.0 μg蛋白当量/mL，而在hFib细胞中该值为181.5 μg蛋白当量/mL。这一差异表明，PELNs对肿瘤细胞的细胞毒性作用强于对正常成纤维细胞的作用。PELN处理以细胞系依赖性方式改变肿瘤细胞的凋亡水平和细胞内ROS水平。GC–MS分析鉴定出十四烷酸（tetradecanoic acid）、9-十六碳烯酸（9-hexadecenoic acid）、9-十八碳烯酸（9-octadecenoic acid）和9-十八碳烯酰胺（9-octadecenamide）为主要成分。研究结果表明，漆树来源PELNs的化学成分与其细胞生物活性之间可能存在值得进一步研究的关系，其选择性抗癌潜力有待通过进一步的机制研究加以验证。

论文解读

一、研究背景与研究意义

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是细胞释放到细胞外基质中的膜结合结构，能够携带蛋白质、脂质、核酸及多种生物活性分子，在细胞间通讯中发挥重要作用，已成为生物医学和纳米生物技术研究的重要焦点。除哺乳动物细胞外，研究人员也已从植物中分离出纳米级囊泡结构，并证实其能够与哺乳动物细胞相互作用。来自可食用植物的类外泌体纳米颗粒（plant-derived exosome-like nanoparticles, PELNs）可被哺乳动物细胞摄取并影响多种生物学过程。例如，来源于葡萄的类外泌体纳米颗粒通过靶向肠道干细胞支持组织再生，并在实验性结肠炎模型中表现出保护作用；来源于柠檬的纳米囊泡可抑制癌细胞增殖并诱导TRAIL介导的细胞死亡。

漆树（Rhus coriaria L.，漆树科Anacardiaceae）是地中海和中东地区广泛食用的植物，富含酚类化合物、黄酮类、鞣质、花青素、有机酸及多种脂质衍生物。已有研究报道漆树提取物具有抗氧化、抗微生物、抗炎和抗增殖特性，并可在MCF-7和PC-3等多种人癌细胞系中抑制增殖，漆树提取物或漆树基纳米颗粒策略中亦观察到细胞毒性和促凋亡效应。然而，现有研究大多集中于漆树提取物或其植物化学组分，关于漆树来源类外泌体纳米颗粒的理化性质、化学成分及其对癌细胞生物学活性的信息仍然有限。

为填补这一知识空白，研究人员从漆树果实中分离并表征类外泌体纳米颗粒，并研究其对不同组织来源的人肿瘤细胞的生物学效应，包括细胞增殖、凋亡和细胞内氧化应激，同时引入正常人成纤维细胞（hFib）作为正常细胞对照，以评估肿瘤细胞与正常细胞之间的细胞毒性差异。

二、主要技术方法

研究人员采用差速离心结合超速离心的方法从商业化漆树果实材料中分离PELNs。具体而言，将干燥漆树果实研磨成粉末后与磷酸盐缓冲液（dPBS）混合过夜孵育，依次经350 × g、10 000 × g和15 000 × g离心去除碎片，再经120 000 × g和150 000 × g超速离心收集纳米颗粒沉淀，最终以0.22 μm无菌滤器过滤后储存于?80°C。表征方面，采用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）评估颗粒形态，采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定粒径分布和颗粒浓度，采用基于微球的流式细胞术检测CD63和CD81四跨膜蛋白标志物反应性，采用BCA法测定总蛋白浓度。化学成分分析采用气相色谱-质谱联用（GC–MS）技术。生物学评价方面，采用MTT法检测细胞增殖/活力并计算IC₅₀值，采用Annexin V试剂盒评估细胞凋亡，采用氧化应激试剂盒检测细胞内活性氧（ROS）水平。细胞系包括A549人肺腺癌细胞、HepG2人肝癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、PC-3人前列腺癌细胞以及正常人成纤维细胞（hFib），均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。

三、研究结果

3.1 PELNs的表征

FE-SEM图像显示，样本主要表现为球形或近球形形态，部分区域存在聚集倾向，从FE-SEM图像计算的平均粒径为95.97 ± 25 nm。NTA分析显示平均粒径为156.5 ± 65 nm，颗粒浓度为4.93 × 10⁸颗粒/mL。两种方法获得的粒径范围与既往报道的PELNs纳米尺度范围一致。PELN制剂的总蛋白浓度为400 μg/mL。基于微球的流式细胞术分析检测到CD63和CD81抗体反应性，表明分离产物具有囊泡相关表面标志物特征。

3.2 PELNs对细胞增殖的影响

MTT实验显示，PELN处理在所有肿瘤细胞系中均导致浓度依赖性细胞活力下降，其中MCF-7细胞敏感性最高。PELNs在A549、HepG2、MCF-7和PC-3细胞中的IC₅₀值分别为55.96、50.0、26.0和49.0 μg蛋白当量/mL，而在hFib细胞中为181.5 μg蛋白当量/mL。选择指数（selectivity index, SI）分别为A549约3.24、HepG2约3.63、MCF-7约6.98、PC-3约3.70，其中MCF-7细胞的选择性最高。正常hFib细胞的IC₅₀值显著高于所有肿瘤细胞，表明PELNs在检测浓度范围内对肿瘤细胞表现出更高的细胞毒活性，并非仅产生一般性细胞毒性，而是具有细胞系特异性的敏感谱。

3.3 PELNs对凋亡和细胞内ROS的影响

Annexin V实验显示，以各细胞系特异性IC₅₀浓度处理PELNs后，与对照组相比，凋亡细胞比例显著增加。在A549、HepG2和MCF-7细胞中，PELN诱导的凋亡反应高于顺铂组，而在PC-3细胞中两种处理诱导的反应相似。hFib细胞在其各自IC₅₀浓度下也观察到凋亡反应。

细胞内ROS分析显示，PELNs的氧化还原反应呈细胞系依赖性。A549细胞中PELN组的ROS阳性细胞比例较对照组未增加，而HepG2、MCF-7和PC-3细胞中观察到上升趋势，其中MCF-7和HepG2细胞中PELN处理诱导了显著的ROS反应。hFib细胞在其较高IC₅₀浓度下ROS阳性细胞比例也有所增加。

3.4 GC–MS化学轮廓分析

GC–MS分析显示PELN制剂中化学轮廓以脂质和脂质衍生物为主。共鉴定出12个面积百分比高于2%的峰，其中4种主要成分相对丰度超过5%。面积百分比最高的成分为十四烷酸（tetradecanoic acid，29.44%），其次为9-十六碳烯酸（9-hexadecenoic acid，12.53%）、9-十八碳烯酸衍生物（9-octadecenoic acid derivative，7.50%）和9-十八碳烯酰胺（9-octadecenamide，6.31%）。研究人员指出，癌细胞中的脂质代谢不应仅视为能量来源，脂肪酸合成、摄取、氧化和膜脂重组可因细胞类型和代谢背景不同而以不同方式影响增殖和细胞死亡。油酸已被报道可在某些肿瘤模型中通过降低细胞增殖诱导凋亡和自噬，含有十四烷酸、9-十六碳烯酸和9-十八碳烯酸的脂肪酸组分已在多种人癌细胞系中研究了抗增殖活性，但这些效应具有化合物、剂量和细胞类型依赖性。

四、讨论与结论

本研究评估了漆树果实来源类外泌体纳米颗粒在多种人肿瘤细胞系中的理化性质、化学轮廓和生物活性。研究观察到PELNs降低了A549、HepG2、MCF-7和PC-3细胞的增殖并增加了凋亡，以细胞系依赖性方式调节了细胞内ROS水平。正常人成纤维细胞（hFib）的纳入揭示了PELN IC₅₀值在hFib细胞中（181.5 μg/mL）显著高于肿瘤细胞（26.0–55.96 μg/mL），支持其体外肿瘤细胞选择性。GC–MS分析表明PELN制剂中存在多种脂质衍生物，主要为十四烷酸、9-十六碳烯酸、9-十八碳烯酸衍生物和9-十八碳烯酰胺。然而，基于当前研究，尚不能建立化学成分与细胞反应之间的直接因果关系。这些发现将漆树来源PELNs定位为天然生物活性纳米结构，值得进一步机制研究；靶向货物分析、纯化合物验证以及适当的体内模型研究是确定其转化潜力的必要条件。