《Plant and Soil》：Mycosphere microbiome assembly and metabolic reprogramming in Phallus rugulosus revealed by multi-omics integration
编辑推荐：
目的：菌际土壤（mycosphere）被定义为受真菌菌丝影响的土壤区域，其中栖息着独特的微生物组，对宿主发育起着关键作用。然而，大型真菌中微生物组的组装规则和代谢功能仍知之甚少。本研究旨在阐明可食用真菌皱盖竹荪（Phallus rugulosus）中的这些过程
目的：菌际土壤（mycosphere）被定义为受真菌菌丝影响的土壤区域，其中栖息着独特的微生物组，对宿主发育起着关键作用。然而，大型真菌中微生物组的组装规则和代谢功能仍知之甚少。本研究旨在阐明可食用真菌皱盖竹荪（Phallus rugulosus）中的这些过程。方法：研究人员整合了宏基因组学（metagenomics）、宏转录组学（metatranscriptomics）和非靶向代谢组学（untargeted metabolomics），比较了皱盖竹荪的菌际土壤（MS）和原土（BS）。结果：在MS和BS之间未检测到α多样性的显著差异，而β多样性分析则显示出显著的分离。MS显著富集了腐生真菌和细菌，其功能基因谱指向参与厌氧碳、氮和硫循环（例如，Patescibacteria、Fibrobacterota、Thermodesulfobacteriota）。功能分析表明，菌际土壤内的代谢从有氧呼吸转向厌氧发酵和耦合的硝化-反硝化作用。代谢组学鉴定出MS中有254种上调代谢物，包括一种信号分子（吲哚-3-甲醛）和防御相关化合物（二氢大豆苷元）。网络分析确定了由Patescibacteria和Fibrobacterota主导的模块1是一个核心判别特征（AUC = 0.92）。偏最小二乘路径建模（PLS-PM, GOF = 0.836）揭示了菌际效应、土壤肥力、微生物重组、功能基因表达和代谢物积累之间存在强烈的正向关联，展现了一个从土壤特性经微生物群落和功能基因到代谢物谱的层级级联。结论：这些发现与三个假设一致：皱盖竹荪富集了特定的微生物类群；功能基因表达随这些类群发生协调变化；并且这些组分形成了一个相互连接的微生物-基因-代谢物网络。这一多组学框架增进了研究人员对真菌-微生物互作的理解，并为未来优化食用菌栽培系统提供了参考信息。
研究背景与科学问题
土壤作为一个高度复杂且异质的微环境，不仅为植物提供物理支撑和养分，也是微生物定殖和功能互作的核心场所。类似于植物根际（rhizosphere），菌际土壤（mycosphere）——即受真菌菌丝和子实体直接影响的那部分土壤——构成了真菌-微生物互作的关键界面。在大型真菌中，土壤微生物对于原基形成和子实体发育起着不可替代的调控作用。已有研究表明，双孢蘑菇、羊肚菌等食用菌的覆土或菌际微生物群落是其子实体形成的核心驱动力。然而，尽管大量证据确立了微生物在大型真菌发育中的关键作用，但其背后的机制，特别是哪些微生物类群参与以及它们通过何种代谢途径发挥作用，仍因方法学限制而大多未解。传统单基因扩增调查受限于引物选择性和群落覆盖度，难以全面阐明微生物的功能潜力和代谢活性。皱盖竹荪（Phallus rugulosus）是一种分布于东亚竹林阴湿环境下的食药两用真菌，其子实体原基的形成依赖于土壤微生物提供的信号分子或营养物质。基于此，研究人员提出了三个假设：（1）皱盖竹荪菌际土壤会显著富集特定微生物类群；（2）与富集微生物类群相关的功能基因表达会发生协调性变化；（3）富集的微生物类群、差异表达的功能基因和差异积累的代谢物之间会形成一个高度互联的互作网络。本研究旨在通过整合宏基因组学、宏转录组学和代谢组学的方法，系统揭示皱盖竹荪菌际微生物组的组装模式、功能动态和代谢重编程。
主要关键技术方法
研究人员于2025年11月在中国陕西省杨凌区（108.05°E, 34.27°N）一片野生竹林采集了5株完整的皱盖竹荪子实体及其周围的原土（BS）和菌际土壤（MS）样品，每组各获得5个生物学重复。研究整合了三种高通量技术：利用宏基因组学结合合成标准品进行微生物群落的绝对定量测序；采用宏转录组学进行全转录组测序；并使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术进行非靶向代谢组学分析。
研究结果
1. 菌际效应对微生物群落结构的重塑
通过对比MS和BS的微生物群落，研究发现α多样性（香农指数和辛普森指数）在两组间无显著差异，但基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度分析（NMDS）显示细菌和真菌群落均呈现显著分离，且真菌群落的响应比细菌更强烈。ADONIS检验证实了这种差异的统计学显著性。
2. 微生物群落组成的变化
在门水平上，MS显著富集了Patescibacteria、Fibrobacterota和Thermodesulfobacteriota等与厌氧碳、氮、硫循环相关的细菌门，以及腐生的Mortierellomycota和Basidiobolomycota真菌门，同时共生型的Glomeromycota显著减少。在科水平上，MS中厌氧化学有机营养菌（Williamwhitmaniaceae）、反硝化菌（Rhodocyclaceae）和木质纤维素分解真菌（Lentitheciaceae、Niessliaceae）丰度升高，而好氧甲烷氧化菌（Methylomonadaceae）和潜在病原真菌（Diatrypaceae、Hypoxylaceae）丰度降低。
3. 土壤理化性质与微生物群落的关系
冗余分析（RDA）表明，前两轴分别解释了细菌和真菌群落总变异的86.9%和80.3%。土壤有机质（SOM）、总氮（TN）、总磷（TP）、总钾（TK）、碱解氮（AN）和有效磷（AP）是驱动微生物群落结构的主要环境因子。相比BS，MS的pH值显著降低，而多数养分指标显著升高。Mantel网络分析进一步证实了养分因子与MS富集的功能类群之间的强关联。
4. 功能通路分析
KEGG功能注释揭示MS中存在明显的代谢转变。在碳循环中，乙醇发酵基因（ald, adh/mdh）显著上调，伴随发酵相关代谢物积累，表明代谢从有氧呼吸转向兼性厌氧发酵。在氮循环中，硝化（amoABC）和反硝化（nirK/S）基因均显著上调，指示耦合的硝化-反硝化过程增强。在硫循环中，MS主导了硫化物氧化途径。此外，与能量代谢、环境感知和分泌互作相关的基因均在MS中显著富集。
5. 代谢组差异分析
正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）清晰区分了MS和BS的代谢谱。共鉴定出254种上调代谢物和58种下调代谢物。上调代谢物集中在核苷酸代谢、氨基酸生物合成和辅因子生物合成通路。值得注意的是，信号分子吲哚-3-甲醛和多种防御相关化合物（如二氢大豆苷元、2-萘酚、三甲氧苄啶）在MS中显著积累。
6. 多组学整合网络与机器学习分析
Procrustes分析确认了代谢组与宏基因组数据间的良好对应关系。Spearman相关性网络分析识别出三个门水平的微生物-基因-代谢物关联模块。Lasso逻辑回归确定模块1（以Patescibacteria和Fibrobacterota为核心）为区分MS和BS的最优特征，曲线下面积（AUC）达0.92。因果中介分析表明，微生物群对代谢物的影响约59.66%是通过功能基因介导的间接效应实现的。偏最小二乘路径建模（PLS-PM，拟合优度GOF=0.836）验证了一个层级级联路径：菌际效应→土壤特性→微生物群落重组→功能基因表达→代谢物积累。
总结与讨论
本研究的发现支持了最初提出的三个假设。菌际效应显著改变了微生物群落组成而非物种丰富度，选择性富集了参与厌氧碳、氮、硫循环的腐生微生物，同时抑制了共生型和潜在致病型真菌，这与羊肚菌、双孢蘑菇等覆土微生物组的研究结果一致。功能分析揭示了从有氧呼吸向厌氧发酵及耦合硝化-反硝化的代谢转变，这可能是菌际微环境中氧气梯度驱动的结果。多组学整合分析进一步证明，微生物、基因和代谢物并非孤立运作，而是形成了以Patescibacteria和Fibrobacterota为核心的紧密功能模块，其中功能基因扮演了关键的桥梁角色。
研究结论：这些发现与三个假设一致，即皱盖竹荪富集了特定的微生物类群，功能基因表达随这些类群发生协调变化，并且这些组分形成了一个相互连接的微生物-基因-代谢物网络。这一多组学框架增进了对真菌-微生物互作的理解，并为未来优化食用菌栽培系统提供了参考信息。
