基于液相色谱-串联质谱法检测脑内共价加合物F-FAD评估赖氨酸特异性脱甲基酶1抑制剂TAK-418的靶点占据

《The AAPS Journal》：Liquid Chromatography/tandem Mass Spectrometry-based Target Engagement of Lysine-specific Demethylase 1 Inhibitor TAK-418 Through Detecting Covalent Adducts in the Brain

将临床前药代动力学（PK）和药效动力学（PD）转化至临床，对于中枢神经系统（CNS）疾病药物的成功开发至关重要。TAK-418是一种赖氨酸特异性脱甲基酶1（LSD1）抑制剂的临床候选药物，具有独特的作用机制；它与黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）共价结合，形成紧密加合物甲酰化FAD（F-FAD），从而将血液学不良反应风险降至最低。在本研究中，研究人员建立了一种基于液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）的方法，用于评估F-FAD作为TAK-418靶点占据标志物，以推进PK/PD转化和临床剂量设定。在大鼠中，LC/MS/MS能够检测TAK-418诱导的脑内F-FAD形成，并与天然FAD实现色谱分离。F-FAD水平与不同脑区的LSD1蛋白丰度呈正相关，并随TAK-418剂量增加而升高。由F-FAD浓度计算的LSD1占据率与大鼠海马中LSD1酶活性抑制水平相关。这种基于机制的方法将脑内共价加合物形成、靶点占据和酶抑制联系起来。此外，在大鼠和人海马匀浆中F-FAD形成的半数有效浓度（EC₅₀）点估计相似，支持F-FAD测量用于LSD1靶点占据转化评估的潜在效用。这些发现为评估TAK-418暴露与LSD1靶点占据之间的转化关系提供了有用信息，并可能支持未来TAK-418的PK/PD建模和临床剂量选择。此外，研究人员测量共价加合物的方法可适用于多种具有共价结合特性的CNS药物候选物。

中枢神经系统（CNS）疾病有效治疗药物的临床研发成功率依然较低，主要原因是缺乏疗效，而动物模型中的疗效对人类临床疗效的预测性有限。转化生物标志物对于将临床前药理学效应转化为临床终点非常重要。然而，由于脑生理学的物种差异、缺乏评估人脑靶点占据的可靠生物标志物以及活检研究困难，CNS药物开发中从临床前到临床的药代动力学（PK）、靶点占据和药效动力学（PD）桥接颇具挑战。赖氨酸特异性脱甲基酶1（LSD1）催化组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）单甲基化和二甲基化的去甲基化，其活性位点含有黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。LSD1功能缺失与Kabuki综合征、自闭症谱系障碍（ASD）和精神分裂症等发育障碍有关，因此LSD1抑制是潜在治疗策略。TAK-418是一种临床阶段的LSD1抑制剂，其独特之处在于与LSD1活性位点中的FAD共价结合，形成紧凑加合物甲酰化FAD（F-FAD），不会与辅因子蛋白产生空间位阻，从而降低血液学不良反应风险。在产前暴露于丙戊酸（VPA）或聚肌苷酸-聚胞苷酸（poly I:C）的神经发育障碍动物模型中，TAK-418在全脑LSD1抑制剂量下改善社交和认知缺陷。因此，确证F-FAD形成并评估人体靶点占据对于外推血液学安全性和确定临床试验给药方案至关重要。已有LSD1正电子发射断层扫描（PET）示踪剂[¹⁸F]T-914，但临床前成像存在分辨率不足和麻醉伪影等局限。基于液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）测定非标记示踪剂的方法已被用于临床前受体占据评估，而共价加合物测量在肿瘤和炎症领域的共价药物中已有应用，但CNS领域尚未广泛探索。因此，研究人员建立了基于LC/MS/MS的F-FAD检测方法，用于评估TAK-418在大鼠脑中的LSD1靶点占据。该研究证实F-FAD可作为靶点占据标志物，并建立了脑内共价加合物形成、靶点占据和酶抑制之间的机制联系，为PK/PD转化和临床剂量选择提供依据。

研究使用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（购自Charles River Laboratories Japan Inc.）进行体内给药实验；离体人脑标本来自Cureline Inc.，包括4例供体的海马和11例供体的小脑。主要技术方法包括：采用LC/MS/MS选择反应监测（SRM）模式（母离子/子离子816.20/348.00）检测F-FAD，通过蛋白沉淀提取脑匀浆中的F-FAD，并利用基质匹配校准曲线定量；采用Western blotting检测各脑区LSD1相对表达量；通过免疫沉淀联合均相时间分辨荧光（HTRF）测定离体LSD1酶活性；将人/大鼠脑匀浆与TAK-418体外孵育，用非线性回归估算最大F-FAD水平（C_F-FAD,max）和半数有效浓度（EC₅₀）。

结果部分：

**Chromatographic Separation and Detection of F-FAD by LC/MS/MS**：研究人员在LC/MS/MS条件下，使用SRM转换816/348检测F-FAD，其保留时间为4.8 min，而天然FAD无此峰，证明F-FAD可与天然FAD实现色谱分离；在经TAK-418处理的LSD1重组蛋白样本和TAK-418给药后的大鼠脑中均检测到F-FAD。

**Relationship Between F-FAD level and LSD1 Expression in Rat Brain Region**：在连续皮下输注TAK-418（16.6 mg/kg/天，264 h）后，各脑区F-FAD水平呈梯度分布，并与未给药大鼠的LSD1蛋白相对丰度呈显著正相关（Y=26.73X?15.88，R²=0.94，p=0.0003），说明F-FAD生成具有LSD1表达依赖性。

**Dose Dependency of F-FAD Levels in Rat Hippocampus After TAK-418 Dosing**：口服TAK-418（0.1–30 mg/kg）后8 h，大鼠海马F-FAD水平随剂量升高而增加，并在高剂量趋于饱和，C_F-FAD,max为2.47 ng/g；同时LSD1剩余酶活性从111.1%降至6.0%，基于F-FAD计算的占据率与LSD1酶抑制之间呈显著正相关（Y=1.16X?16.42，R²=0.92，p=0.0024）。

**F-FAD Formation in Human and Rat Brain Homogenates After Incubation with TAK-418**：在0.1–10,000 nmol/L TAK-418浓度下，人海马、大鼠海马和人小脑匀浆中F-FAD形成随浓度增加而增加；非线性回归估计的C_F-FAD,max分别为0.721、0.917和2.71 ng/g，EC₅₀点估计分别为6.75、9.05和5.09 nmol/L。人海马EC₅₀的置信区间下限无法估计，敏感性分析显示该参数存在不确定性；但人鼠海马EC₅₀点估计相近，支持进一步转化评估。

讨论部分指出，研究人员建立的LC/MS/MS方法通过蛋白沉淀和色谱优化，成功将F-FAD与天然FAD分离，并证实F-FAD水平与LSD1表达相关、随剂量增加而饱和，且基于F-FAD的占据率与大鼠脑内LSD1酶抑制直接相关，支持F-FAD作为靶点占据和酶抑制指标的潜在价值。体外脑匀浆实验中，人鼠海马EC₅₀点估计相近，但人海马参数精度有限；体内和体外分析的定量策略不同，体外结果应视为探索性比较信息。与PET示踪剂[¹⁸F]T-914相比，LC/MS/MS方法无需PET设施，且不依赖抗体即可特异评价LSD1占据。该策略类似于KRASG12C抑制剂和布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂的共价加合物占据评价，并扩展到化合物与靶蛋白辅酶相互作用的新机制。结合临床前药效模型，这些结果可为评估人体中可能相关的LSD1靶点占据水平提供基础，并支持未来PK/PD建模和剂量选择。

研究结论：研究人员建立了一种基于LC/MS/MS的方法，通过检测脑内F-FAD评估LSD1靶点占据。研究结果支持F-FAD作为靶点占据标志物的效用，因为在TAK-418给药后的大鼠脑中，基于F-FAD的LSD1占据率与LSD1酶抑制相关。此外，TAK-418诱导的F-FAD形成在大鼠和人海马匀浆中的EC₅₀点估计相似，为进一步转化评估提供了基础。这些发现为表征临床前模型中的药理学效应提供了相关信息，并可能支持未来TAK-418的PK/PD建模和临床剂量选择。此外，这种测量共价加合物的方法可为共价药物的靶点占据评估提供有价值的应用。