《Ecology and Evolution》：Plastomes of Ten Blumea Species (Asteraceae): Comparative Analysis and Phylogenetic Relationships
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艾纳香属（Blumea，菊科 Asteraceae）包含约100种，分布于热带亚洲、非洲和澳大利亚，其中许多具有药用价值。然而，由杂交导致的形态变异使该属分类学问题尚未解决。在本研究中，研究人员组装了6种艾纳香属植物（B. repanda、B. axillar
艾纳香属（Blumea，菊科 Asteraceae）包含约100种，分布于热带亚洲、非洲和澳大利亚，其中许多具有药用价值。然而，由杂交导致的形态变异使该属分类学问题尚未解决。在本研究中，研究人员组装了6种艾纳香属植物（B. repanda、B. axillaris、B. sinuata、B. martiniana、B. megacephala和B. formosana）的叶绿体基因组（chloroplast genomes），并将其与4个已发表种（B. oxyodonta、B. tenella、B. aromatica和B. balsamifera）的叶绿体基因组进行比较。6个新质体基因组（plastomes）大小相似（150,783–151,281 bp），具有典型四分体结构，各自包含131个基因（86个蛋白编码基因、37个tRNA和8个rRNA）。比较分析揭示了保守的基因组结构、稳定的反向重复区/单拷贝区边界（IR/SC boundaries），且未发现重排。鉴定出6个非编码区和4个编码区作为候选DNA条形码（DNA barcodes）。共鉴定出395个散在重复序列（dispersed repeats）、79个串联重复序列（tandem repeats）和547个简单重复序列（SSRs）。在59个偏好密码子（preferred codons）中，29个为高频密码子（相对同义密码子使用度 RSCU > 1），其中28个以A/U结尾。此外，在21个基因中检测到正选择（positive selection），例如ycf1、ycf2、rpoB和ndhA。基于23个分类群（21个旋覆花族 Inuleae 物种加2个外类群）的系统发育分析（最大似然法 ML 和贝叶斯推断 BI）显示，Blumea 是一个获得高度支持的单系群（自举支持率 BS = 100%，后验概率 PP = 1.00），内部划分为三个亚支：亚支I（B. axillaris、B. oxyodonta、B. megacephala、B. repanda、B. sinuata和B. tenella）、亚支II（B. balsamifera）和亚支III（B. aromatica、B. formosana和B. martiniana），后三者均属于大叶组（Section Macrophylla）。这些基因组资源为未来 Blumea 的系统发育、群体遗传学和生物技术研究奠定了基础。
艾纳香属（Blumea）是菊科（Asteraceae）旋覆花族（Inuleae）最大属，约100种，分布于热带亚洲、非洲和澳大利亚，生活型包括草本、灌木和小乔木。该属具盘状头状花序、瘦果表皮细胞内单个大草酸钙晶体、花药内壁径向加厚及具尾花药等特征。由于杂交导致形态变异、异质性状和独特性状，Blumea 分类长期复杂。中国曾依据形态将该属分为6个组：Sect. Dissitiflorae、Sect. Macrophillae、Sect. Oxyodontae、Sect. Paniculatae、Sect. Sagittatae、Sect. Semivestitae。此前基于质体标记 trnL-F、psbA-trnH 和核位点 ITS、5S-NTS 的研究未能解决该属与近缘属关系及种间复杂关系。该属多种具药用价值，其中 B. balsamifera（大风艾）含 L-borneol，是中药艾片的唯一植物来源。叶绿体（chloroplast，cp）基因组通常为115–165 kb环状DNA，具大单拷贝区（LSC）、小单拷贝区（SSC）和两个反向重复区（IR）组成的四分体结构，因母系遗传、缺乏重组、结构稳定而广泛用于植物系统发育研究。下一代测序使质体基因组组装更快捷。因此，研究人员组装6种 Blumea 新质体基因组，并与4个已发表质体基因组比较，目标为：呈现新质体基因组；比较10种 Blumea 基因组结构；明确 Blumea 在 Inuleae 中的系统位置。该研究扩展了 Blumea 基因组资源，为系统发育、群体遗传学和生物技术研究提供基础。
关键技术方法方面，研究人员从中国云南采集6种 Blumea（B. megacephala、B. formosana、B. axillaris、B. sinuata、B. repanda、B. martiniana），凭证标本存贵州师范学院植物标本馆（GEUH），鉴定由 Yuemei Zhao 和 Changjiang Qian 完成；另从 GenBank 获取4个已发表种。DNA经 Illumina HiSeq 2500 双端测序，由北京 Biomarker Technologies Inc. 完成。用 Fastp 过滤、GetOrganelle 组装、CPGAVAS2 注释、Geneious Prime 校正、OGDRAW 制图；mVISTA、Mauve、DnaSP 作比较；Tandem Repeats Finder、REPuter、MISA 查重复；MEGA 12、TBtools 分析密码子；MAFFT、IQ-TREE、MrBayes 建树；HyPhy 的 FUBAR 和 MEME 检测选择。
研究结果如下。3.1 质体基因组特征：6个新质体过滤读长24.7–37.3 M，Q20为96.81%–98.77%，Q30为91.83%–96.47%，覆盖度107.48×–564.91×。大小从150,783 bp（B. sinuata）至151,281 bp（B. formosana），均具典型四分体结构：IR为24,924–24,957 bp，LSC为82,524–82,894 bp，SSC为18,355–18,509 bp。GC含量37.5%–37.6%，IR最高43%，LSC为35.6%–35.7%，SSC为30.8%–31.0%。每个质体含131个基因：8个rRNA、37个tRNA、86个蛋白编码基因，其中18个在IR中复制。9个蛋白编码基因和6个tRNA基因含一个内含子，rps12、clpP、ycf3各含两个内含子，表明基因组高度保守。3.2 Blumea 种间序列分歧：MAUVE筛查未检测到重排。mVISTA显示IR较SC保守，编码区较非编码区保守，Pi计算一致。非编码区变异0.19%–8.36%（平均3.82%），LSC平均4.21%，IR为0.87%，SSC为6.25%；6个非编码区变异超过6%，包括 trnH-psbA、rps16-trnQ-UUG、atpI-atpH、ycf4-cemA、ndhG-ndhI、rps15-ycf1。编码区变异0%–3.70%（平均1.25%），LSC平均1.27%，IR为0.37%，SSC为1.92%；ycf1、rps8、ndhF、matK变异最高。非编码区分歧为编码区3.06倍，IR较SC保守，表明 Blumea 进化相对保守。3.3 Blumea 质体比较：IR/SC边界总体保守，局部有限变异。LSC/IRb边界处，rps19位于LSC，距接点10–13 bp；rpl2位于IRb，距52–60 bp。IRb/SSC边界处，截短 ycf1 横跨连接，9种向SSC延伸0–21 bp；B. balsamifera 中该拷贝假基因化。ndhF 位于SSC，距IRb/SSC 1–40 bp，并在6种（B. megacephala、B. repanda、B. sinuata、B. axillaris、B. tenella、B. oxyodonta）与 ycf1 重叠。SSC中完整 ycf1 跨越SSC/IRa，向IRa延伸564–581 bp。IRa/LSC边界处，rpl2 和 trnH 在10个质体中分别距接点52–60 bp和2–4 bp，提示边界基因可作分子标记。3.4 重复序列分析：共鉴定395个散在重复，包括181个正向、202个回文、11个反向和1个互补重复；B. axillaris 最多49个，B. martiniana 最少34个。正向和回文重复存在于所有种，反向重复见于6种，互补重复仅见于 B. tenella。多数位于LSC和IR，少数位于SSC；多在基因间间隔区，少数在内含子或编码序列。30–39 bp重复最多，40–49 bp次之，超过50 bp最少。另鉴定79个串联重复。共547个SSR，种间类型和数量变化；单、二、三、四核苷酸SSR均存在于所有种，五核苷酸见于6种，六核苷酸仅见于 B. formosana。B. formosana 最多63个，B. martiniana 最少50个。单核苷酸最多425个（77.70%），其次为四核苷酸61个（11.15%）、三核苷酸29个（5.30%）、二核苷酸25个（4.57%）、五核苷酸6个（1.10%）、六核苷酸1个（0.18%）。单核苷酸中A/T为417个，G/C为8个，AT富集。SSR位于LSC 75.87%、IR 14.26%、SSC 9.87%；基因间间隔区65.81%、内含子19.38%、编码区14.81%；编码区主要分布于 rpoB、rpoA、ycf1、rpoC1、rpoC2、psbC、ndhD，提示cpSSR可作候选分子标记。3.5 密码子使用偏好分析：52个符合过滤标准CDS编码18,281–19,764个密码子。59个密码子具偏好，29个RSCU>1，其中28个以A/U结尾；30个RSCU<1，其中28个以C/G结尾。UUA（Leu）RSCU最高1.89–1.94，AGC（Ser）最低0.32–0.33。Leu最多2023–2177个密码子（10.97%–11.07%），Cys最少211–224个（1.12%–1.16%）；AUU（Ile）最多810–876个，UGC（Cys）最少54–65个，表明偏好A/U结尾密码子。3.6 系统发育分析与基因选择压力分析：基于23个分类群79个共享CDS基因建ML和BI树。21个Inuleae物种分4大支：Clade I仅 Tugarinovia mongolica；Clade II包括 Anaphalis yunnanensis、Helichrysum argyrophyllum、Gnaphalium polycaulon、Filago arvensis、Leontopodium sinense、Laggera crispata、Pluchea pteropoda；Clade III包括 Carpesium abrotanoides、Pentanema britannicum、Inula hupehensis；Clade IV为 Blumea 10种。Blumea 为高支持单系群，分三亚支：亚支I含 B. axillaris、B. oxyodonta、B. megacephala、B. repanda、B. sinuata、B. tenella，其中 B. sinuata 与 B. tenella 姐妹，B. megacephala 与 B. repanda 姐妹，四者成支后与 B. axillaris 和 B. oxyodonta 姐妹；亚支II为 B. balsamifera，是亚支I姐妹；亚支III含 B. aromatica、B. formosana、B. martiniana，B. martiniana 为基部，B. aromatica 与 B. formosana 姐妹，三者均属 Section Macrophylla。BI树中10种 Blumea 拓扑与ML完全一致；其他类群有微小差异，如BI中 Laggera crispata 和 Pluchea pteropoda 与 Carpesium abrotanoides 及其近缘聚类，而ML中与 Anaphalis yunnanensis 支聚类。选择压力分析中，FUBAR未检测到普遍正选择位点；MEME检测到21个基因含显著正选择位点，ycf1 有75个位点最多，ycf2 有17个，rpoB 有7个。这些基因主要参与光合（psaA、psaB、psbA）、能量代谢（atpA、atpF、atpI）、基因转录（rpoB、rpoC1）和蛋白合成（rpl20、rps12），提示 Blumea 适应进化可能涉及多通路协调调整。
讨论部分总结：10个质体高度保守，四分体结构符合菊科，新测序6种大小处于被子植物典型范围。质体各含130–131个基因，基因数目和顺序高度保守，无重排或倒位。IR GC含量高，与rRNA等高GC基因有关，有助于质体基因组稳定。IR扩张收缩普遍，本研究中LSC/IRb、SSC/IRa、IRa/LSC边界一致，IRb/SSC略有差异：6种 ycf1 与 ndhF 重叠，4种不重叠；系统发育支持重叠6种更近缘，不重叠的 B. martiniana、B. formosana、B. aromatica 聚在一起，B. balsamifera 独立。边界基因可作群体遗传分子标记。长重复对质体重排和稳定性重要；395个散在重复数量、类型和分布保守，多为30–39 bp回文或正向重复，与其他被子植物相似。SSR对群体遗传和系统发育重要，547个SSR中单核苷酸最多，多为A/T，符合质体SSR短polyA/polyT特征，多位于非编码区，可作候选分子标记。mVISTA显示高度保守，非编码变异大于编码，Pi一致；trnH-psbA、ycf1、matK 可作属级系统发育高分辨标记；rps12、rpl23 等光合和翻译核心基因完全保守，功能约束强。密码子偏性普遍，10种质体密码子使用模式相同，多数偏好A/U结尾，UUA（Leu）最高，AGC（Ser）最低，Leu最多而Cys最少，与菊科多物种一致。Blumea 分类争议长期存在，分子标记研究曾识别 B. densiflora 支、B. lacera 支及 B. balsamifera 独立谱系；本研究支持“两支加一独立种”框架，但未观察到两个亚支间生境、生态或分布一致差异，亚支I和亚支III均出现一年生与多年生混合，提示生活史策略演化更复杂。B. balsamifera 独立，可能经历不同进化历史，且不能排除保留祖先性状。Section Macrophylla 三种在ML和BI中强支持为单系，与形态传统一致；IR/SSC边界 ycf1 和 ndhF 重叠模式与拓扑一致，可作谱系识别辅助结构特征。ITS和5S-NTS在属间有信息，但不足以解决种间近期辐射；核-质拓扑冲突与单亲遗传和网状进化有关，整合单拷贝核基因或完整质体数据重要。ML树中 Laggera crispata 和 Pluchea pteropoda 未与 Blumea 聚，而与 Gnaphalieae 聚类，BI中与 Carpesium abrotanoides 更近，拓扑不稳定可能与 Inuleae 属界限未解决有关；Laggera 可能为多系，结果总体支持 Laggera 与 Pluchea 近缘。正选择方面，21个候选基因沿 Blumea 谱系，功能涉及光合、能量代谢、转录和翻译，提示多通路协调适应；光合相关基因和能量代谢基因占比最大，NADH脱氢酶复合体基因及 accD 与光合适应性相关；rpoB、rpoC1、matK、rpl20、rps12 表明质体基因表达系统协调调整；cemA 可能与光合效率或光适应相关；ycf1 和 ycf2 编码质体内膜蛋白转运复合体关键组分，在 Blumea 中正选择位点最多，可能重要。FUBAR未检测到普遍正选择，说明上述信号为 Blumea 支系特异性偶发事件，与质体基因组主要受纯化选择、适应性信号偶发出现一致。总体上，Blumea 质体适应进化主要表现为多通路、谱系特异性偶发正选择，可能促进不同生境适应分化。
结论翻译：在本研究中，研究人员组装了6种 Blumea 的完整叶绿体基因组，并与4个已发表基因组一起进行比较基因组和系统发育分析。所有10个质体在基因顺序、大小、结构和GC含量上高度保守，未检测到重排。共鉴定395个散在重复、79个串联重复和547个SSR。密码子使用显示强烈偏好A/U结尾密码子。鉴定出6个非编码区和4个编码区作为候选DNA条形码。在21个基因中检测到偶发正选择。系统发育分析恢复 Blumea 为高度支持的单系群，含三个亚支：亚支III包括 B. aromatica、B. formosana 和 B. martiniana（均属于 Section Macrophylla），亚支II为 B. balsamifera，亚支I为其余6种。该拓扑支持先前认识的“两亚支加一独立谱系”框架；然而亚支内生活型混合表明生态适应演化比先前认为更复杂。这些结果为 Blumea 系统发育和适应演化研究提供基因组基础，鉴定的SSR和候选条形码可能促进分子标记开发和群体遗传学。尽管如此，采样有限；鉴于核标记（ITS、5S-NTS）在解决近期辐射中分辨率有限，未来纳入更多代表性物种及核基因组或转录组数据，将能更全面理解该属系统发育框架和适应演化。
