重新评估胎生蟑螂 Diploptera punctata 母体与胚胎微生物组：非 Blattabacterium 类群的环境获得性、组成变异与功能推断局限

《Ecology and Evolution》：Does Mother Provide? Re-Examination of Maternal and Embryonic Microbiomes of Diploptera punctata

　　

蟑螂内共生菌 Blattabacterium cuenotii 在宿主整个发育过程的营养中发挥核心作用，尤其是在胎生蟑螂 Diploptera punctata 的胚胎发生过程中。然而，该物种发育胚胎中非 Blattabacterium 类群的存在及其潜在功能相关性仍不清楚。既往基于 Illumina 16S rRNA 测序的 D. punctata 母体与胚胎微生物组研究得出了不一致的结果，部分原因在于对内共生序列的处理方式不同。在此，研究人员重新分析了来自两项研究的微生物组数据，分别包含和不包含 Blattabacterium reads，以重新评估胚胎微生物组中非 Blattabacterium 类群的存在与组成。胚胎微生物群落（1）在不同数据集之间彼此存在显著差异，且（2）与相关母体肠道群落存在显著差异，提示环境因素（母体、饮食和实验室）和测序因素可能影响其获得与组成，而非反映一个稳定、持续传播的微生物组。尽管如此，在胚胎微生物组中检测到非 Blattabacterium 类群提示发育中的胚胎可能获得非内共生细菌。这些微生物的功能被推测，但本研究未明确检验，仍有待验证。总体而言，研究人员的发现提示，尽管非内共生胚胎细菌可能为环境获得且可变，其生物学相关性仍未解决，并且不能仅由 16S 扩增子（amplicon）数据确定。这凸显了研究获得性非内共生细菌及其在胎生蟑螂发育中的潜在功能作用的重要性。

研究背景与问题：昆虫中垂直传播的内共生体（endosymbiont）对宿主营养、防御、发育和生长具有重要作用。蟑螂（Blattodea）的 Blattabacterium cuenotii 为垂直传播的内共生菌，位于胚胎和胚后阶段脂肪体菌细胞（bacteriocytes）内，可循环氮废物并合成必需氨基酸。蟑螂还携带更可变的肠道相关微生物群，通常由新孵若虫通过食粪从环境水平获得。然而，已有证据提示，蟑螂卵和新孵若虫在食粪前可能存在非 Blattabacterium 类群。在胎生蟑螂 Diploptera punctata 中，胚胎在育囊内发育并持续接受营养性“乳汁”分泌。Ayayee et al. (2017) 发现胚胎中若干非 Blattabacterium 类群相对相关雌性富集，并提出这些细菌可能通过合成乳汁中稀缺且 Blattabacterium 无法合成的甲硫氨酸和色氨酸，补充胚胎营养；Jennings et al. (2019) 则认为没有显著的非 Blattabacterium 类群或其潜在功能与胚胎发育相关。两项研究的关键方法差异之一是 Ayayee et al. (2017) 在微生物组分析中排除了 Blattabacterium reads，而 Jennings et al. (2019) 保留了这些 reads；此外，实验室、饮食和方法差异也可能导致不一致。因此，非 Blattabacterium 微生物是否存在于发育中的 D. punctata 胚胎、其组成如何及是否具有生物相关性仍未解决。研究人员因此重新分析两项已发表 16S rRNA 扩增子（16S rRNA amplicon）数据集，分别含和不含 Blattabacterium reads，以评估与发育胚胎相关的非 Blattabacterium 微生物的存在、可能继承和组成，并用有限分类推断评估其潜在功能。该研究的意义在于澄清既往争议，并为后续实验验证环境获得性非内共生细菌在胎生蟑螂发育中的潜在作用提供框架。

关键技术方法概述：研究人员从 NCBI SRA 获取 Ayayee et al. (2017)（PRJNA314839；7 个雌性肠道和 8 个胚胎样本）与 Jennings et al. (2019)（PRJNA522760；20 个雌性肠道和 22 个胚胎样本）的 16S rRNA 扩增子数据，共 57 个成年雌性肠道和胚胎样本，排除若虫。使用 DADA2 进行质控和去嵌合，生成扩增子序列变异（amplicon sequence variants, ASVs），并以 SILVA 138.1 注释。分别保留和剔除 Blattabacterium reads 后构建分析表：前者 11,693 个 ASVs，稀释至 3,740 reads/样本；后者剔除 224 个 Blattabacterium/Blattabacteriaceae ASVs 后为 11,469 个 ASVs，剔除 <100 reads 样本并稀释至 112 reads/样本。采用 Chao1、Shannon、Bray-Curtis、PERMDISP、PERMANOVA、Kruskal-Wallis 和 FAPROTAX 分析。样本来源为 Ayayee et al. (2017) 的 UC 群体和 Jennings et al. (2019) 的 OSU 群体。

研究结果：

3.1 含 Blattabacterium reads 的微生物组多样性与组成分析（Diversity and Compositional Analyses of Microbiomes With Blattabacterium Reads）：质量处理后保留合并数据集 62% 的原始 fastq reads。基于 Chao1 的总细菌和古菌物种数在四类样本间差异显著，雌性肠道样本最高，胚胎样本较低，Jennings_Embryo 最低。Shannon 指数也显示雌性肠道微生物组更均衡，Jennings_Embryo 最不均衡。组成分析显示，PERMDISP 表明四类样本离散度差异显著，PERMANOVA 表明群落组成差异显著（F=30.026；R²=0.63；p=0.001；Stress=0.08），但因不满足同质性假设，差异可能同时来自真实群落变化和离散度差异。Ayayee_Female_gut、Ayayee_Embryo 与 Jennings_Female_gut 组成较相似，Jennings_Embryo 分离；Ayayee_Embryo 与雌性肠道聚类可能主要受胚胎中 Blattabacterium reads 主导，较少由非 Blattabacterium reads 的差异丰度驱动。FAPROTAX 发现 23 个差异潜在功能类别；雌性肠道富集好氧化学异养（aerobic chemoheterotrophy）、发酵、硫酸盐呼吸、硫化合物呼吸和尿素分解等潜在功能；胚胎样本主要与胞内寄生虫和尿素分解潜在功能相关，Ayayee_Embryo 还富集好氧化学异养、化学异养、烃降解和发酵，显示其非 Blattabacterium reads 较多。

3.2 不含 Blattabacterium reads 的微生物组多样性与组成分析（Diversity and Compositional Analyses of Microbiomes Without Blattabacterium Reads）：剔除 Blattabacterium reads 后，Chao1 和 Shannon 仍显示类别差异，雌性肠道丰富度最高，Ayayee_Embryo 居中，Jennings_Embryo 最低且最不均匀。PERMDISP 不显著，样本满足同质性；PERMANOVA 显著（F=4.40；R²=0.25；p>0.001；Stress=0.14），差异反映真实群落组成变化。Ayayee_Female_gut、Ayayee_Embryo 与 Jennings_Female_gut 较相似，Jennings_Embryo 仍分离，但与其他类别重叠增加。FAPROTAX 发现 10 个差异潜在功能类别：Ayayee_Female_gut 富集烃降解和甲基还原产甲烷；Jennings_Female_gut 富集人肠道、人类病原、人类相关、尿素分解和哺乳动物肠道类别；两组雌性肠道共有好氧化学异养、硫酸盐呼吸和硫化合物呼吸。胚胎样本中好氧化学异养、硫酸盐呼吸和尿素分解差异富集，提示相关非 Blattabacterium 类群可能参与这些过程；Ayayee_Embryo 烃降解显著而 Jennings_Embryo 可忽略，Jennings_Embryo 富集人肠道、人类病原、人类相关、尿素分解和哺乳动物肠道类别。原文强调污染和非特异分类不能排除，功能仅为潜在推断。

讨论部分总结：研究人员指出，昆虫—细菌关联可影响宿主适合度，但在研究肠道微生物组生态时应区分肠道微生物与菌细胞中专性内共生体，因为二者获得方式、动态、功能和选择压力不同。剔除内共生体 reads 有利于研究肠道微生物组组成。该研究重新检查了唯一可用的 D. punctata 母体与胚胎微生物组数据集。剔除 Blattabacterium 后，Jennings_Embryo 与 Ayayee_Embryo 的多样性和组成差异显著；Jennings_Embryo 主要由 Enterobacteriaceae 和 Dysgonomonadaceae 两个非 Blattabacterium 科主导，Ayayee_Embryo 含 Fusobacteriaceae、Halomonadaceae、未指定 Alteromonadales 和未指定 Gammaproteobacteria 四个主导类群。检测到非 Blattabacterium 类群提示胚胎可能获得这些细菌，但实验室环境、饲养条件、饮食和处理方法可能影响其组成。该发现挑战了 Jennings et al. (2019) 关于非 Blattabacterium 序列对胚胎发育不重要或主要反映测序伪影或误分类的解释。母体微生物组多样性较高时胚胎微生物组多样性也较高， Jennings 样本二者均较低，提示环境或实验室依赖效应。差异可能源于群体历史、饮食、适应时间和实验程序：Jennings et al. (2019) 的蟑螂从 Ohio State University 昆虫饲养室转移后仅适应 1 周，而饮食相关微生物变化常需 ≥10 天；Ayayee et al. (2017) 使用 UC 群体，历史饲料为 Red Flannel Hi-Protein Formula dog food， Jennings et al. (2019) 使用 OSU 昆虫饲养室群体，饲料为 Tetramin fish food。总体上，发育中的 D. punctata 胚胎存在非 Blattabacterium 细菌，但其是否为稳定胚胎相关细菌或瞬时环境/污染信号仍需进一步研究。功能推断方面，原文强调 FAPROTAX 得到的是潜在功能类别而非实际功能，需要实验验证。乳汁缺乏色氨酸和甲硫氨酸，而 Blattabacterium 缺乏相关生物合成途径；Halomonadaceae 和 Shewanellaceae 曾被认为可能提供这些必需氨基酸，近期也显示成年雌性肠道细菌可提供必需氨基酸。本研究中检测到 Halomonadaceae 和硫还原细菌，为检验其是否参与胚胎必需氨基酸供给提供机会。硫酸盐还原和硫呼吸潜在类别可能参与含硫氨基酸如甲硫氨酸和半胱氨酸合成；Ayayee_Embryo 中烃降解功能可能通过芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AhR）途径和多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbon, PAH）降解途径参与色氨酸相关代谢；尿素分解富集可能参与尿素水解和氮供给，补充 Blattabacterium。原文建议用 rifampicin 或 chlortetracycline 减少共生体和肠道微生物，产生准无共生体（quasi-aposymbiotic）第三或第四代群体，结合 16S 测序、RNA-seq、X 射线衍射和质谱表征乳汁，并测量标准代谢率，以区分预测代谢潜能与实际表达且具生物学相关性的功能。

研究结论部分翻译：总体而言，重新检查来自 Diploptera punctata 母体和胚胎的两个可用 16S 扩增子数据集揭示了若干新见解。在发育胚胎中检测到非 Blattabacterium reads。相关母体肠道微生物组显示可能的环境（实验室）和饮食特异性差异。这些母体微生物组差异可能影响胚胎微生物组的存在与组成，无论其来源为母体、环境还是污染物。16S 扩增子数据限制功能解释；这些发现凸显了研究与非 Blattabacterium 微生物相关的生物学作用的潜在途径。进一步研究母体和胚胎微生物组将有助于阐明塑造这种胎生蟑螂微生物群落的复杂因素。