《Epilepsia》：Transcriptomic analysis reveals distinct expression patterns in focal cortical dysplasia
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目的：局灶性皮质发育不良（focal cortical dysplasia，FCD）是儿童和成人药物难治性癫痫的常见病因，具有显著的临床和组织病理学异质性。然而，仅凭形态学分类并不能完全解释癫痫发生能力、疾病严重程度或治疗反应的差异。
方法：研究人员旨在通过整
目的：局灶性皮质发育不良（focal cortical dysplasia，FCD）是儿童和成人药物难治性癫痫的常见病因，具有显著的临床和组织病理学异质性。然而，仅凭形态学分类并不能完全解释癫痫发生能力、疾病严重程度或治疗反应的差异。
方法：研究人员旨在通过整合转录组和调控分析来阐明FCD异质性背后的分子机制。研究人员对66例经组织病理学确诊的FCD亚型IA（n=17）、IIA（n=25）和IIB（n=24）患者在癫痫手术中切除的皮质组织，以及15例死后皮质对照样本，进行了RNA和小RNA测序（RNA-seq）。采用差异表达分析和加权基因共表达网络分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）来识别协调的转录程序，并整合microRNA（miRNA）谱以评估转录后调控机制。使用整合多变量分析（DIABLO和稀疏偏最小二乘判别分析，sparse partial least squares discriminant analysis，sPLS-DA）评估亚型区分能力，并使用独立的RNA-seq数据集进行验证。
结果：FCD亚型表现出不同但部分重叠的分子谱。FCD IA显示出相对微妙的转录谱，以参与皮质发育、神经元信号传导、离子调节和代谢应激的基因表达减少为主。FCD IIA表现出适度但连贯的分子特征，涉及发育和神经元破坏，以及代谢应激和自噬。FCD IIB表现出最广泛的转录重塑，包括抗原呈递通路激活、补体激活、细胞骨架重组、突触改变和细胞外基质组织。差异miRNA谱分析确定了共享miRNA，包括miR-320家族、miR-27a-5p、miR-142-5p和miR-21-5p，以及亚型特异性调控模式。信使RNA（messenger RNA，mRNA）和miRNA数据的整合揭示了一致的变化，表明miRNA失调可能有助于稳定亚型特异性转录状态。
意义：这些发现表明，FCD的特征是协调的转录和转录后网络改变，这些改变超越了形态学分类，并可能有助于解释各亚型间癫痫发生能力的差异。
一、研究背景与科学问题
局灶性皮质发育不良（focal cortical dysplasia，FCD）是儿童和成人药物难治性局灶性癫痫的常见病因，国际抗癫痫联盟（International League Against Epilepsy，ILAE）依据新皮层细胞构筑异常将其分为FCD I、II、III型及轻度皮质发育畸形（mild malformations of cortical development，mMCD）等类别。尽管组织病理学是FCD诊断的金标准，但各亚型间组织学特征存在重叠，观察者间差异显著，且形态学分类无法完全解释癫痫发生能力、疾病严重程度和手术预后的异质性。在遗传学层面，FCD II型的病因已较明确，MTOR、PIK3CA、AKT3、TSC1/2等PI3K-AKT-mTOR信号通路基因的体细胞变异已被反复报道，且GATOR1复合物组分的功能缺失突变与FCD IIA特异性相关；相比之下，FCD I型在分子层面仍缺乏一致性复现的遗传驱动因素。此外，FCD组织中检出的体细胞变异等位基因频率低、局限于有限细胞群体，其非细胞自主效应对周围神经微环境的影响难以仅通过突变分析全面捕捉。因此，亟需从组织水平的全局分子改变角度，利用转录组学手段识别反映细胞组成和疾病相关生物学状态的协调分子通路，以补充形态学分类的不足。
二、研究设计与技术方法
研究人员构建了一个包含81例皮质组织样本的队列，其中66例为FCD组织（FCD IA，n=17；FCD IIA，n=25；FCD IIB，n=24），15例为无癫痫或神经系统疾病史的尸检皮质对照样本，样本来自捷克布尔诺圣安妮医院及布拉格莫托尔和霍莫尔卡大学医院2018—2024年间接受癫痫手术的患者。研究采用的主要技术方法包括：批量RNA测序（RNA-seq）和小RNA测序（small RNA-seq）分别用于表征全局转录改变和microRNA（miRNA）表达谱；加权基因共表达网络分析（WGCNA）用于识别协调的基因表达程序；差异表达分析（DESeq2）用于筛选显著差异基因；整合多变量分析（DIABLO框架和稀疏偏最小二乘判别分析，sPLS-DA）用于评估mRNA与miRNA的跨组学关系及亚型判别能力；并使用独立RNA-seq数据集（GSE256068）进行外部验证。
三、研究结果
3.1 亚型特异性mRNA失调，FCD IIB转录组变化最强
RNA-seq平均每样本产生约3000万条读数，约27000个基因被检出。线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）显示FCD组织与尸检对照明显分离，各亚型间部分重叠。差异表达分析发现，与对照相比，FCD IA有297个基因差异表达，FCD IIA有92个，FCD IIB有290个（校正p<.05，|log2FC|>1.5）。亚型间直接比较进一步支持FCD IIB在转录水平上与FCD IA和FCD IIA均显著区分，而FCD IA与FCD IIA分子重叠较大。
3.2 差异miRNA表达谱区分FCD亚型与对照
小RNA-seq平均每样本产生约1500万条读数，共检出970个独特miRNA。LDA显示FCD与对照组织明显分离。与对照相比，FCD IA、IIA和IIB分别有28、24和29个差异表达miRNA（padj<.05，|log2FC|>1）。亚型间直接比较同样支持FCD IIB的分子独特性。miRNA-mRNA整合相关分析揭示了有限但共享和亚型特异性的调控模式：miR-27a-5p、miR-142-5p和miR-21-5p与免疫和炎症基因相关，miR-320家族与代谢应激相关基因相关；在FCD IIB中，miR-21-5p与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑基因相关。
3.3 基因共表达网络分析识别亚型相关分子模块
WGCNA构建了含17个基因模块的有符号共表达网络。相关性分析显示，FCD IA与单一模块（紫色，r=.41）显著相关，该模块富集于细胞黏附和ECM组织通路，包括ECM-受体相互作用、黏着斑、整合素信号和钙黏蛋白信号。FCD IIA与四个模块显著相关，其中salmon模块（r=.35）在参考数据集中强保留，富集于染色质修饰和表观遗传调控通路，包括多梳抑制复合物和组蛋白赖氨酸甲基化。FCD IIB与五个模块显著相关（红色r=?.37、蓝色r=?.43、午夜蓝r=?.40、绿黄色r=.63、绿松石色r=.43），均被标记为亚型内在且强保留，富集以神经元/突触信号为主，包括谷氨酸能和GABA能突触、神经递质受体信号和长时程增强，同时检测到大量免疫/感染相关通路，提示FCD IIB存在神经炎症参与。
3.4 整合多组学揭示中等判别力但具有亚型信息量的分子特征
DIABLO整合分析确定了73个mRNA和17个miRNA对亚型判别有贡献，mRNA模块平衡错误率（balanced error rate，BER）为.33，miRNA模块为.41，对应67%和59%的准确率，表明模型提供中等程度的类别判别。聚类图像热图显示FCD IIA样本被特征分为两个亚块，且FCD IIA与其他亚型的分离最为明显。基于mRNA模块更高的分类准确率，研究人员进一步采用sPLS-DA单组学算法，结合外部数据集扩展队列后，共选择156个判别特征基因，其中22个与DIABLO方法定义的基因重叠，最终模型BER为.26，准确率达74%，较DIABLO结果提升7%，FCD IIB样本形成更明显的独立聚类。
四、讨论与结论
讨论部分指出，FCD IA呈现以发育、神经元信号、离子调节和代谢相关基因下调为主的分子谱，免疫和应激相关基因富集有限，提示其为分子层面较微妙的亚型，主要表现为发育和神经元程序减少。FCD IIA的差异基因谱提示发育和神经元程序破坏与炎症、代谢和应激相关重塑并存的组合分子表型，其下调基因涉及Wnt相关发育信号、神经内分泌受体活性、细胞黏附、囊泡运输和细胞骨架相关功能。FCD IIB则表现出最显著的转录反应，ECM重塑、免疫激活、补体信号、抗原呈递和组织损伤反应相关基因显著富集，其中TREM2/SPP1/GPNMB共表达特征与神经退行性和癫痫背景下鉴定的疾病相关小胶质细胞状态高度吻合；ECM和重塑基因的协同上调提示组织微环境的活跃重构。miRNA分析显示，miR-320家族、miR-142-5p、miR-206等为各亚型共享的失调miRNA，而亚型特异性模式提示从FCD IA到FCD IIB调控复杂性递增，FCD IIB以miR-21-5p、miR-21-3p和miR-152-5p等炎症和重塑相关miRNA谱为特征。网络层面，FCD IIB的共表达模块与既往研究中鉴定的ECM激活调节子高度一致。整合多变量分析表明mRNA和miRNA联合可适度改善亚型判别，外部数据集验证支持了分子分型的稳健性和转化潜力。
研究结论为：FCD的组织病理学亚型对应不同但部分重叠的分子网络状态；神经炎症和细胞骨架重塑广泛参与发育不良皮质，而代谢、突触和结构通路的相对贡献因亚型而异，这些差异可能影响癫痫发生能力和手术结局的变异性。研究也承认其局限性，包括批量组织分析受细胞组成影响、手术切除组织可能高估炎症和即早基因信号、小RNA文库制备的连接偏差未评估，以及关键基因和通路需要RNA和蛋白质水平的实验验证。
