基于定量 PCR 和液滴数字 PCR 的 DNA 甲基化分析同时鉴定唾液与精液

《Legal Medicine》：Simultaneous identification of saliva and semen by DNA methylation analysis using quantitative PCR and droplet digital PCR

DNA甲基化标记物能够可靠地鉴定唾液和精液。液滴数字PCR能够在低DNA浓度下实现准确定量。液滴数字PCR比定量PCR对PCR抑制物表现出更强的耐受性。本研究展示了液滴数字PCR在DNA甲基化分析中的应用。**引言**DNA甲基化是一个将甲基基团（-CH?）沉积到DNA上的过程。它在各种生物学过程中发挥着至关重要的作用，包括基因表达、细胞分化和基因组印记[1]。这种表观遗传修饰主要发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）岛内的胞嘧啶残基上[2]。DNA甲基化模式反映了遗传和环境因素（如衰老、饮食、压力和生活方式）的影响[3]、[4]、[5]。DNA甲基化分析已成为一种补充性的法医工具，用于提供调查线索。它通过提供嫌疑人的时间年龄以及对其生活方式的洞察（如吸烟和饮酒情况）来帮助缩小嫌疑人范围[6]、[7]、[8]。分析组织特异性DNA甲基化模式还可以确定犯罪现场证据的体液类型[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。此外，一些研究探讨了DNA甲基化分析区分单卵双胞胎的潜力，这些双胞胎此前因其遗传上相同的STR图谱而难以区分[18]、[19]。传统的DNA甲基化研究依赖于大量并行测序（MPS）或单碱基延伸（SBE）检测等技术，例如SNaPshot[7]、[10]、[11]、[12]、[13]、[15]、[16]。然而，MPS需要文库制备、测序和生物信息学分析，耗时且成本高昂。SNaPshot检测需要在毛细管电泳之前进行两个酶促步骤和一个纯化步骤[10]、[12]、[13]、[16]。为了减少操作步数，我们设计了针对多个CpG位点的引物和探针，并使用定量PCR（qPCR）和液滴数字PCR（ddPCR）评估了体液鉴定性能。使用qPCR是为了确保检测方法的实际应用性和与标准实验室设置的兼容性。使用ddPCR是因其对抑制物的高耐受性和绝对定量能力[20]。2022年，Lee等人使用ddPCR检测唾液中年龄相关CpG位点的甲基化状态，并为每个CpG位点的甲基化和未甲基化拷贝设计了探针以计算甲基化水平[21]。遵循与Lee等人[21]类似的策略，我们为每个候选CpG位点独立设计了两种探针：一种与甲基化序列互补，另一种与未甲基化序列互补。然后我们评估了它们在各种体液样本中的性能。结果表明，仅使用与甲基化序列互补的探针即可实现体液鉴定，因为与未甲基化序列互补的探针无论体液类型如何均被扩增。因此，与未甲基化序列互补的探针被排除在后续实验之外。这一结果表明，唾液和精液中并非所有体液特异性标记物内的CpG位点都是完全甲基化的，且甲基化水平在细胞间存在差异[22]。在本研究中，我们开发了qPCR和ddPCR检测方法，用于利用DNA甲基化标记物（cg09652652-2d和cg17610929）同时鉴定唾液和精液。为了评估这些检测方法的性能，我们使用各种体液样本（唾液、精液、血液、月经血、阴道分泌物和鼻腔分泌物）进行了验证实验。该检测方法的灵敏度低至5拷贝/μL，整体特异性高，仅在cg09652652-2d标记物中对鼻腔分泌物有轻微交叉反应。此外，我们通过分析模拟法证样本（包括降解样本或含腐殖酸样本）证明了其法证实用性。我们的结果表明，这些检测方法可以有效区分唾液和精液与其他体液，为传统甲基化分析方法提供了一种稳健且高效的时间替代方案。**章节摘要****DNA提取、定量和亚硫酸氢盐转化**唾液（n = 11）和精液（n = 13）样本由志愿者收集至50 mL锥形管中。由于样本量不足，13个精液样本中的3个被排除在降解和抑制测试之外，因此这些实验使用剩余的10个精液样本进行。血液样本（n = 11）由持证护士通过静脉穿刺采集至3 mL EDTA管中。月经血（n = 3）、阴道分泌物（n = 3）和鼻腔分泌物（n = 3）样本为**DTT对ddPCR液滴生成的影响**在ddPCR中，每个液滴充当独立的PCR反应腔，促进独立的PCR反应[26]。因此，ddPCR的效率从根本上依赖于液滴生成，液滴数量增加对应PCR性能的增强。尽管制造商建议在ddPCR反应混合物中加入DTT，但在已发表的研究中DTT对液滴生成的确切影响仍不清楚。为了澄清这一点，我们评估了DTT添加对的影响**讨论**本研究证明了ddPCR在基于DNA甲基化的体液鉴定中的实用性。与qPCR相比，ddPCR提供了更优的灵敏度、精确度和可靠性。由于这些优势，ddPCR已被广泛应用于需要定量低丰度DNA靶标的应用中，包括基因表达分析[27]、拷贝数变异[28]、[29]、[30]以及病原体检测[31]。此外，与MPS和SNaPshot检测方法相比，ddPCR**结论**在本研究中，使用唾液特异性标记物（cg09652652-2d）和精液特异性标记物（cg17610929）进行ddPCR，鉴定了10个唾液样本和13个精液样本。所有样本均被成功鉴定，未对犯罪现场常见的血液、月经血和阴道分泌物样本产生非特异性反应。然而，在鼻腔分泌物样本中观察到唾液特异性标记物的轻微扩增。唾液和的灵敏度均为5拷贝/μL**参与同意**根据IRB编号SKKU 2023–05-002，唾液、精液和血液样本从提供书面知情同意用于研究的健康捐献者处收集。根据IRB编号SKKU 2025–05-025，月经血、阴道分泌物和鼻腔分泌物样本同样从提供书面知情同意用于研究的健康捐献者处收集。**伦理批准**所有样本均按照韩国成均馆大学机构审查委员会批准的程序收集（IRB编号SKKU 2023–05-002，IRB编号SKKU 2025–05-025）。所有程序均符合《赫尔辛基宣言》的原则。**资金**本研究由国家法医科学服务局（项目编号NFS-2025-DNA-03）和韩国基础科学院（国家研究设施与设备中心）资助，由教育部拨款支持（资助编号2020R1A6C101A191）。**利益冲突声明**作者声明，他们没有任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。**致谢**作者衷心感谢所有DNA捐献者的自愿参与。我们还感谢国家法医科学服务局和韩国基础科学院（国家研究设施与设备中心）的支持。So Eun Lee | Un Na Koh | Rita Fakhr | Soo Yeon Lim | Si-Keun Lim