基于23S rRNA靶向逆转录定量PCR系统快速检测与定量肠杆菌目细菌的开发及应用研究

《Microbiology and Immunology》：Development and Application of a Rapid 23S rRNA-Targeted Reverse Transcription Quantitative PCR System for the Detection and Quantification of Enterobacterales

隶属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌在人体中既可以作为共生菌存在，也可以作为病原菌存在。多重耐药细菌日益流行已引起全球关注。2016年，随着基于基因组学的分类学分析将肠杆菌科物种重新分类为肠杆菌目（Enterobacterales），这一分类框架发生了重大变化。然而，目前尚未有在现行目级分类学框架下设计并验证的针对肠杆菌目的定量检测方法。因此，研究人员旨在开发一种基于23S rRNA的新型逆转录定量PCR（RT-qPCR）系统，用于定量检测肠杆菌目细菌。该系统被用于定量肠杆菌目物种，并利用来自99例胃肠道癌症患者和10名健康志愿者的粪便样本评估了其适用性。此外，研究人员还对其在碳青霉烯耐药肠杆菌目（CRE）抗菌药物敏感性快速评估中的应用价值进行了概念验证评价。该系统表现出较高的分析灵敏度，能够定量包括新分类物种在内的多种肠杆菌目细菌，理论检测限为103 cells/g粪便和1 cell/mL血液。在健康志愿者中，肠道肠杆菌目以大肠杆菌（Escherichia coli）和肠杆菌属（Enterobacter）为主，而术前胃肠道癌症患者则表现出更大的菌群多样性。在体外实验中，抗生素处理后2小时经RT-qPCR系统测定的CRE活菌计数与24小时后基于培养法的药敏结果高度相关，提示该系统可在6小时内实现抗菌药物敏感性的快速评估。所开发的23S rRNA RT-qPCR系统提供了一种在当前分类学框架内定量肠杆菌目的灵敏方法，并可能有助于快速评估针对CRE的抗菌活性。

论文解读文章

一、研究背景与意义

肠杆菌科细菌广泛分布于自然界，许多物种栖息于包括人类和昆虫在内的动物肠道中，既可充当共生菌，也可作为病原菌引发多种疾病，如食源性疾病、胃肠炎、围手术期感染、癌症化疗期间的并发症以及与生活方式相关的疾病。多重耐药肠杆菌科细菌的日益流行已成为全球关注的重大公共卫生问题。2016年，基于基因组学的分类学分析对原肠杆菌科进行了重组，建立了肠杆菌目这一新的目级分类单元，并设立了六个新科（Budviciaceae、Erwiniaceae、Hafniaceae、Morganellaceae、Pectobacteriaceae和Yersiniaceae），部分原属肠杆菌科的细菌被重新分类至这些新科，同时也有新物种不断被纳入。截至2026年8月，肠杆菌目已包含八个科。

分类学的上述发展凸显了建立能够按照现行分类学框架检测和定量肠杆菌目细菌的方法的必要性。既往研究采用了培养法、PCR法和16S rRNA基因大规模测序等手段来检测或定量肠杆菌科及相关菌群，但迄今为止，尚未有专门针对现行目级分类学框架下肠杆菌目进行定量检测的23S rRNA靶向逆转录定量PCR（RT-qPCR）方法被设计和验证。因此，开展本研究具有重要的科学意义和临床应用价值。

二、研究内容与主要结论

研究人员开发了一套基于23S rRNA的肠杆菌目特异性引物（o-Enbac-F/o-Enbac-R），并建立了相应的RT-qPCR定量系统。该系统表现出高分析灵敏度和良好的定量性能，能够定量包括新分类物种在内的多种肠杆菌目细菌，理论检测限为10³ cells/g粪便和1 cell/mL血液。在99例胃肠道癌症术前患者和10名健康志愿者的粪便样本应用中，该系统成功定量了所有样本中的肠杆菌目细菌。健康志愿者肠道肠杆菌目以大肠杆菌和肠杆菌属为主，而癌症患者则表现出更大的菌群多样性，包括克雷伯菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属等与术后感染并发症相关的菌属占比增加。此外，研究人员还对该系统在碳青霉烯耐药肠杆菌目（CRE）抗菌药物敏感性快速评估中的应用进行了概念验证，结果显示抗生素处理后2小时经RT-qPCR测定的活菌计数与24小时后培养法药敏结果高度一致，提示可在约6小时内完成药敏评估，显著快于传统培养法所需的24小时以上。

三、主要技术方法

本研究采用的主要关键技术方法包括：基于多序列比对和生物信息学分析的引物设计方法，利用CLUSTAL_X对87种肠杆菌目物种和26种相关物种的23S rRNA基因序列进行比对，结合NCBI BLAST和SILVA数据库大规模序列进行特异性的计算机模拟验证；一步法RT-qPCR定量技术，采用One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit在QuantStudio 12K Flex实时荧光定量PCR系统上进行扩增，通过标准曲线实现细菌绝对定量；DAPI染色显微镜计数法用于确定标准菌液浓度；临床粪便样本来自名古屋大学医院2019年1月至2022年5月期间收治的99例拟行高侵袭性腹部手术的胃肠道癌症患者以及10名健康成人志愿者；RT-qPCR扩增产物经纯化和Sanger测序后进行BLAST同源性比对以鉴定细菌种类；体外抗菌药物敏感性评估实验采用两株临床分离的CRE菌株（Citrobacter freundii complex 20-195和Klebsiella pneumoniae 21-520），分别使用敏感和耐药抗生素组合处理，比较RT-qPCR法与培养法的活菌计数结果。

四、研究结果

4.1 新设计引物集的特异性检验

利用新设计的引物集对68株细菌进行RT-qPCR检测，结果显示仅37株肠杆菌目菌株和2株CRE临床分离株产生阳性扩增信号，而6株肠杆菌目近缘物种、19株肠道细菌和6株人类感染相关细菌（含2株CRE）中的非靶标菌株均无扩增，证实该引物集在测试条件下对肠杆菌目具有高度特异性。基于NCBI数据库113条23S rRNA基因序列的比对分析以及SILVA数据库23,741条序列的大规模计算机模拟评估进一步预测，该引物集可扩增98.0%的肠杆菌目分类群，且无非特异性扩增证据。

4.2 新设计引物的检测灵敏度与RT-qPCR定量性能

对包括两株CRE菌株在内的8株肠杆菌目菌株，DAPI染色计数与RT-qPCR的C_q值在每反应10^?2至10⁴个细菌细胞的RNA量范围内表现出良好的相关性，8株菌株的线性回归分析参数高度一致，表明定量性能具有可比性。此外，该方法用于血液细菌定量时，理论上可从低至1 cell/mL的浓度进行检测。

4.3 胃肠道癌症患者与健康志愿者粪便样本中肠杆菌目的定量

利用新引物对99例术前胃肠道癌症患者和10名健康志愿者的粪便样本进行RT-qPCR定量，肠杆菌目在全部样本中均被检出。患者组平均细菌载量为10^7.74±1.38 cells/g粪便，健康组为10^7.78±0.95 cells/g，两组间无统计学显著差异。但99例患者中有2例出现高达10¹⁰ cells/g的极端高值。对RT-qPCR扩增产物进行测序和同源性比对分析发现，健康志愿者中肠杆菌目以大肠杆菌或志贺菌属（80%）和肠杆菌属（20%）为主；而癌症患者中菌群分布更为多样，除大肠杆菌或志贺菌属（37.4%）和肠杆菌属（16.2%）外，还检测到克雷伯菌属（18.2%）、拉乌尔菌属或克雷伯菌属（5.0%）、柠檬酸杆菌属（5.0%）、阪崎克罗诺杆菌（2.0%）和沙门菌属（1.0%），另有15.2%属于未鉴定或其它类别，其中包括新纳入肠杆菌目的Phytobacter属和Pseudocitrobacter corydidari新种。

4.4 利用RT-qPCR预测抗生素对碳青霉烯耐药肠杆菌目的杀菌活性

将Citrobacter freundii complex 20-195和Klebsiella pneumoniae 21-520两株CRE菌株分别用敏感抗生素组合（PL-B+AMK、PL-B+TGC、MEPM+TGC）和耐药抗生素（IPM/CS、FOM、AZT）处理。RT-qPCR检测结果显示，敏感抗生素处理后2小时存活率即显著下降至12%–62%（20-195株），24小时进一步降至0.2%–20%；21-520株在2至24小时之间也出现大幅下降。而耐药抗生素处理2小时后未见显著存活率下降，24小时仍几乎无变化。培养法结果与RT-qPCR法一致：敏感抗生素处理24小时后两株菌均降至检测限以下（<10 CFU/mL），耐药抗生素处理24小时几乎无减少。这表明RT-qPCR在抗生素处理后2小时即可定量CRE活菌并与24小时培养法药敏结果良好吻合，整个药敏评估流程约需6小时即可完成。

五、讨论总结与结论

讨论部分指出，在临床实践中监测粪便、血液、尿液和痰液等标本中活菌数量对于了解患者感染动态至关重要。本研究开发的引物集不仅覆盖传统分类的肠杆菌目物种，还能检测新纳入的属如Phytobacter、Scandinavium、Superficieibacter和Chimaeribacter等。在设计引物时，研究人员最初尝试了16S rRNA靶标，但仅有少数候选区域对肠杆菌目具有特异性且扩增效率不佳，而23S rRNA序列多样性更高，能够在物种水平提供更好的区分能力，最终成功开发出兼具高特异性和定量性能的引物。该方法是首个将靶向细菌rRNA的肠杆菌目特异性引物应用于临床样本的研究。

在胃肠道癌症患者中，肠杆菌目菌群多样性增加，克雷伯菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属等与术后感染并发症相关的菌属占比升高，提示术前控制肠道感染菌的重要性。序列分析还在癌症患者粪便中鉴定出Phytobacter——一种新近报道可引起败血症的细菌。该方法理论上可检测低至1 cell/mL血液中的肠杆菌目，有望应用于血液、尿液、痰液、器官、肠系膜淋巴结和癌组织等多种临床标本。此外，该方法可通过添加多种细菌特异性引物集同时检测多种细菌和基因表达水平。

对于CRE的药敏评估，RT-qPCR法可在抗生素处理后2小时定量活菌，约6小时即可获得药敏结果，显著快于传统培养法所需的24小时以上。该方法对作用于细菌细胞膜（如PL-B）和抑制蛋白质合成（如AMK、TGC）类抗生素的效果确认尤为有用，且能检测培养法无法检出的活菌但不可培养状态细菌。

研究也存在局限性：PL-B、AMK和TGC联合用药毒性较高，可能限制其临床应用；仅使用了两株CRE菌株，普适性有待更大规模菌株验证；CRE可通过水平基因转移跨物种获得耐药基因，整合耐药基因检测可能进一步增强该方法的实用性；RT-qPCR等快速高灵敏基因检测方法目前主要限于研究用途，临床推广仍需解决成本、专业人员培训和临床证据积累等问题；引物集在下一代测序方法中的潜在适用性有待实验验证。

研究结论：本研究基于现行分类学框架开发了靶向肠杆菌目的高灵敏度RT-qPCR系统，证明了其在临床样本中的适用性，并展示了其作为CRE抗菌药物敏感性快速评估方法的潜力。