整合scRNA-Seq与空间转录组学揭示CHPF和GPC1作为结直肠癌癌相关成纤维细胞主导空间域及ADAM12相关成纤维细胞程序的标志物

《Cancer Medicine》：Integrated scRNA-Seq and Spatial Transcriptomics Reveal CHPF and GPC1 as Markers of Cancer-Associated Fibroblast–Dominant Domains in Colorectal Cancer

结直肠癌（CRC）肿瘤微环境（TME）的空间异质性与基质组织密切相关，并可能影响治疗相关特征。在本研究中，研究人员整合了CRC组织的单细胞RNA测序（scRNA-Seq）和空间转录组学数据，以检查癌相关成纤维细胞（CAF）主导的空间域。GPC1和CHPF在基质区域富集，并在CRC组织中较正常组织表达更高。在分析的队列中，单变量分析显示较高的GPC1和CHPF表达与晚期临床病理特征和较差的生存结局相关。单细胞分析显示GPC1和CHPF主要在成纤维细胞中表达，并富集于一个ADAM12相关成纤维细胞亚群，该亚群具有肌成纤维细胞样特征、细胞外基质相关基因及缺氧/糖酵解相关特征。细胞–细胞通讯分析提示该成纤维细胞亚群与更高的推断WNT信号相关。药物反应和免疫治疗相关分析进一步显示，GPC1和CHPF表达与治疗反应相关转录组模式相关。在黏蛋白腺癌（MA）中，ADAM12相关成纤维细胞程序显示更强的推断MIF相关信号，并与巨噬细胞M2样特征相关。空间定位和多重免疫荧光支持GPC1、CHPF和ADAM12在CAF富集基质区域的部分共定位。在CAF中，GPC1或CHPF敲低降低ADAM12、CAF激活标志物和WNT/MIF相关蛋白，而ADAM12敲低在共培养模型中减弱巨噬细胞M2样标志物表达。这些发现提示GPC1和CHPF标记一个ADAM12相关CAF程序，该程序与CRC尤其是MA中的基质重塑和免疫相关特征相关，但需进一步研究以界定其功能作用。

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）仍是全球重大癌症负担，2022年估计新发超过190万例、死亡超过90万例。尽管靶向治疗和免疫治疗取得进展，转移性CRC长期结局仍差，治疗抵抗涉及瘤内异质性和肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）内动态互作。CRC TME具有显著空间和功能异质性，癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAF）参与基质重塑、免疫调节和肿瘤进展。已有单细胞研究描述炎症型、肌成纤维细胞型、抗原呈递型和代谢型CAF样程序，但许多研究仍从已知CAF标志物或预定义成纤维细胞亚群出发。尚不清楚CAF主导空间域本身可浮现哪些基因，以及这些基因代表何种生物学状态。空间标志物若能与明确基质背景如细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑、WNT/MIF相关信号或免疫细胞互作相联系，则更有价值。研究人员因此分析公共CRC单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-Seq）和空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）数据集，从空间域而非预定义CAF标志物出发，采用高维加权基因共表达网络分析（high-dimensional weighted gene co-expression network analysis, hdWGCNA）识别域相关基因模块，发现GPC1和CHPF为基质富集基因，与CAF主导区域相关。虽然GPC1和CHPF已在癌细胞或肿瘤进展中研究，但其与CRC CAF空间组织关系尚不清楚。研究人员进一步整合bulk转录组分析、伪时间分析、非负矩阵分解（non-negative matrix factorization, NMF）、细胞–细胞通讯推断和空间定位，确定这些标志物代表的成纤维细胞状态。结果表明GPC1和CHPF与ADAM12相关CAF状态相联系，具有肌成纤维细胞样CAF（myofibroblast-like CAF, myCAF）样、ECM相关、缺氧/糖酵解相关和WNT/MIF相关特征。组织与细胞水平验证支持GPC1/CHPF与该ADAM12相关CAF状态的关联。总体而言，该研究识别GPC1和CHPF为CRC CAF主导空间状态的标志物，并将其置于ADAM12相关成纤维细胞背景中，尤其与黏蛋白腺癌（mucinous adenocarcinoma, MA）基质重塑相关。

关键技术方法方面，研究人员整合公共scRNA-Seq数据集E-MTAB-8410、GSE183916和GSE231559，以及ST数据集GSE267401、GSE236697和GSE236696，并分析TCGA CRC队列（647例肿瘤和51例匹配非癌样本）、GEO、HPA、TISCH2和SPATCH资源。主要方法包括Seurat规范相关分析整合、Banksy空间域分割、SpaCET去卷积、SpaTopic整合、hdWGCNA、NMF、Monocle3伪时间、CellChat通讯推断、TIDE评分、scTenifoldKnk虚拟敲低，以及多重免疫荧光、Western blot、siRNA敲低和Transwell共培养。临床样本来自南京中医药大学附属医院30例非特殊型结直肠腺癌和15例MA；回顾性队列纳入40例MSI-H/dMMR晚期CRC接受一线帕博利珠单抗治疗者。

3.1 CAF主导空间域标志基因的鉴定。研究人员分析GSE267401中两个CRC ST样本C1和C2，基于推断拷贝数变异和表达特征划分interface、stroma和tumor区域，并用Banksy识别C1八个、C2七个空间域。聚焦CAF富集域CellTopic8（C1）和CellTopic4（C2），二者细胞组成不完全相同，提示样本异质性。hdWGCNA识别C1和C2各11个基因模块，C1的GM4和C2的GM1分别在相应CAF主导域高表达。交集得到GPC1、CHPF、IDS、SOCS3、MXRA7和CYBC1六个基因。Cox回归显示较高GPC1和CHPF表达与CRC患者较差的OS、DSS和PFI相关。

3.2 GPC1和CHPF的临床相关性分析。额外数据集显示GPC1和CHPF高表达与较差预后相关。TCGA配对队列中，两基因在CRC组织较配对正常组织表达显著升高；TCGA和GEO非配对样本中同样升高。HPA免疫组化显示CHPF蛋白在CRC组织较正常肠组织染色更高。高表达与晚期T分期、N分期和病理分期相关，GPC1高表达还与M分期相关。多变量调整后，GPC1仍与较短PFI相关，提示其与疾病进展关系较稳定。

3.3 GPC1和CHPF与CRC成纤维细胞相关特征相关。整合三个scRNA-seq数据集共180,460个细胞，鉴定20个细胞簇并注释为19种主要细胞类型。GPC1和CHPF主要在基质细胞表达，以成纤维细胞最强。提取11,050个成纤维细胞并分为12个亚群，伪时间分析显示两条从正常肠黏膜来源成纤维细胞向原发肿瘤来源成纤维细胞的推断轨迹；沿轨迹GPC1和CHPF随ACTA2、COL12A1、COL1A1和FAP等CAF相关标志物升高。bulk数据中两基因与成纤维细胞丰度正相关，高表达病例HE显示更高基质成分。共识分子亚型分型中，两基因在CMS2和CMS3较高。

3.4 GPC1和CHPF主要表达于ADAM12⁺成纤维细胞。按组织来源分组，GPC1和CHPF在腹膜转移和肝转移来源成纤维细胞中几乎不表达。对成纤维细胞进行NMF鉴定9个元程序，MP4与GPC1和CHPF关联最强。蛋白–蛋白互作网络将ADAM12定为中心基因。MP4富集胶原基质形成相关信号。bulk和scRNA数据均显示GPC1/CHPF与ADAM12正相关。ADAM12⁺成纤维细胞显示myCAF特征及较高缺氧和糖酵解Hallmark评分。ST显示ADAM12、GPC1、CHPF、myCAF特征和缺氧/糖酵解信号在C1和C2的CAF主导域共定位。ADAM12、GPC1和CHPF在肿瘤核心来源成纤维细胞中高于外周。肝转移ST中这些基因在CAF主导域几乎不表达，而在恶性区域较高，提示ADAM12⁺成纤维细胞在肝转移中可能少见。

3.5 ADAM12⁺成纤维细胞在CRC TME中显示更高推断WNT相关通讯。CellChat分析显示ADAM12⁺和ADAM12^?成纤维细胞总体通讯强度相近，T细胞为通讯中心节点。WNT信号在ADAM12⁺成纤维细胞中具有更高外发通讯分数，发送和接收分数也较高，WNT5A和WNT2表达更高。TCGA-CRC中GPC1、CHPF和ADAM12与WNT通路特征评分正相关。ST中CAF主导域与邻近区域持续显示WNT相关互作模式，并属于WNT信号较高来源域。

3.6 GPC1和CHPF与免疫治疗相关特征及较低预测厄洛替尼（erlotinib）敏感性相关。三个公共免疫治疗队列中，响应者GPC1或CHPF表达低于非响应者。TCGA-CRC中高GPC1或CHPF表达者TIDE评分较高，且两基因与多个免疫检查点相关基因正相关。回顾性40例dMMR/MSI-H转移性CRC一线帕博利珠单抗（pembrolizumab）单药队列中，GPC1高表达组响应率低于低表达组。GDSC数据预测显示GPC1和CHPF高表达与包括厄洛替尼在内的多种化合物预测IC₅₀较高相关。

3.7 ADAM12⁺成纤维细胞在MA中显示独特推断信号模式。MA较非黏液腺癌（non-mucinous adenocarcinoma, NMA）具有更高CHPF和ADAM12表达；MA中高GPC1或CHPF患者生存呈较差趋势但无统计学显著差异。分析MA scRNA-seq数据集GSE236696的46,914个细胞，注释为11种主要细胞类型，GPC1、CHPF和ADAM12主要在成纤维细胞和血管周细胞富集。成纤维细胞再聚类为6个亚群，GPC1、CHPF和ADAM12表达与缺氧/糖酵解评分一致，且GPC1/CHPF与ADAM12正相关。CellChat显示MA中ADAM12⁺成纤维细胞总体通讯强度高于ADAM12^?成纤维细胞，WNT、TGFβ、ANGPTL、MIF、CALCR、ANNEXIN和CXCL通路外发活动更高。MA ST样本分为6个空间域，GPC1、CHPF和ADAM12在CAF主导域重叠分布，该域WNT和MIF信号活性较高。虚拟扰动分析中，CHPF或GPC1敲除与WNT5A、WNT3A、WNT2和MIF表达降低相关。

3.8 GPC1/CHPF相关ADAM12⁺成纤维细胞程序的实验验证。在30例独立非黏液腺癌CRC队列中，多重免疫荧光显示GPC1、CHPF和ADAM12信号主要在ACTA2/α-SMA富集基质区，线扫描显示部分空间重叠。CAF中siRNA敲低GPC1或CHPF后，ADAM12表达降低，成纤维细胞活化及ECM相关标志物α-SMA、FAP和COL1A1降低，WNT5A、WNT2、WNT3A和MIF也降低。敲低ADAM12后，与THP-1来源巨噬细胞Transwell共培养显示M₂相关标志物CD163和CD206荧光强度降低。MA与NMA组织多重免疫荧光显示MA中GPC1、CHPF和ADAM12荧光强度更高。

讨论部分总结：CRC TME具有复杂空间异质性，与肿瘤进展和治疗抵抗相关。该研究通过整合scRNA-seq和ST发现CRC组织形成interface、stroma和tumor等不同空间域，并据此识别GPC1和CHPF为CAF主导域富集基因，其高表达与晚期TNM和较差预后相关。既往研究报道GPC1通过TGF-β/SMAD2信号促进CRC进展，CHPF通过MAPK通路调节肿瘤细胞增殖，其他肿瘤类型中也与侵袭性特征相关。公共转录组分析提示GPC1/CHPF与免疫相关特征如调节性T细胞浸润和PD-1表达相关。进一步分析将GPC1和CHPF置于ADAM12相关成纤维细胞程序，该程序具有myCAF样、胶原基质、缺氧/糖酵解和WNT相关通讯特征。ADAM12作为金属蛋白酶曾与乳腺癌转移相关，在多癌中与基质重塑、胶原沉积、成纤维细胞活化及免疫抑制或治疗相关表型相关。非经典WNT信号与抗肿瘤免疫活性降低相关，并与免疫检查点抑制剂和靶向治疗获益有限相关。敲低GPC1或CHPF降低WNT和MIF相关分子表达，公共队列中高GPC1/CHPF表达也与WNT/MIF相关信号及预测免疫治疗反应降低和厄洛替尼敏感性相关。MA较NMA具有更强CAF激活，本研究显示MA中CHPF和ADAM12在基质区更高，临床验证中GPC1、CHPF和ADAM12蛋白在MA高于NMA。MA高GPC1/CHPF患者生存趋势较差但未达显著，可能与样本量有限有关。局限包括：部分发现依赖生物信息推断，如细胞通讯、通路评分、TIDE、药敏预测和虚拟扰动，均为间接且依赖公共数据集和算法设置；ST样本量有限和spot水平分辨率不能精确定位单个ADAM12⁺ CAF；功能实验主要评估CAF相关蛋白和巨噬细胞M₂样标志物，未直接评估肿瘤生长、侵袭、免疫逃逸或治疗反应；免疫治疗分析部分依赖替代终点，回顾性帕博利珠单抗队列和MA亚组较小，临床发现应视为探索性。

结论翻译：总之，该研究整合scRNA-seq和空间转录组学以表征CRC TME的空间异质性。研究人员确定GPC1和CHPF为与CAF主导域相关的标志物，并将其与具有基质重塑、myCAF样及WNT/MIF相关特征的ADAM12相关成纤维细胞程序相联系。在MA中，该程序显示更强的推断信号活性，而GPC1、CHPF和ADAM12在临床组织样本中显示更高蛋白表达，尽管这些发现仍处于探索性阶段。总体而言，研究人员的发现支持GPC1和CHPF作为ADAM12相关CAF程序的标志物，并为进一步研究其在CRC中的生物学和治疗相关性提供基础。