MdIAA14b自然调控变异通过生长素信号调控苹果果实细胞密度与硬度

《Plant Physiology and Biochemistry》：Natural regulatory variations of MdIAA14b links auxin signalling to fruit cell density and firmness in apple

：果实硬度是影响苹果（Malus × domestica）品质的重要农艺性状，但生长素响应调控因子在苹果果实硬度中的作用机制尚不明确。研究人员鉴定出MdIAA14b为调控苹果果实硬度的关键生长素响应因子。通过等位基因特异性表达（allele-specific expression, ASE）分析发现，MdIAA14b在苹果果实中表现出显著的等位基因差异表达，这一现象由启动子区域的两个顺式调控变异驱动：一个9-bp的ARF结合位点插入和一个1,636-bp的转座子（transposable element, TE）插入。双荧光素酶报告实验证实，9-bp插入为MdARF1介导的启动子激活所必需。携带高表达MdIAA14b等位基因的苹果品种表现出更高的细胞密度和增强的果实硬度。番茄（Solanum lycopersicum）转基因验证进一步证实了MdIAA14b在调控果实硬度中的功能，过表达MdIAA14b的转基因番茄果实细胞密度增加、果实硬度显著提高。该研究揭示了转座子插入、lncRNA破坏与生长素信号整合的顺式调控机制，为苹果果实品质的遗传改良提供了新靶点。

论文解读

一、研究背景与科学问题

果实硬度是苹果品质的核心指标之一，直接影响消费者偏好、采收期判定和货架期长短。过软或过硬的果实质地均被视为品质缺陷。作为数量遗传性状，苹果果实硬度受多基因效应和外部环境因素的共同调控。此前研究已鉴定出多个控制苹果果实硬度和成熟的QTL及候选基因，包括乙烯相关基因MdACO1、MdACS1、MdERF4、NAC18.1及其下游细胞壁基因MdPG1和MdEXP7。然而，生长素响应调控因子在苹果果实硬度中的作用机制尚不清楚。

生长素信号通过TIR1/AFB受体感知，促进Aux/IAA抑制因子降解，进而激活调控细胞分裂和扩张相关基因的ARF转录因子。在苹果中，MdAux/IAA2等Aux/IAA基因可调控细胞数量和果实大小，但Aux/IAA家族成员是否参与果实硬度调控缺乏直接证据。此外，果实大小与硬度之间的关系尚不明确。顺式调控变异导致的等位基因特异性表达（ASE）是作物表型多样性的重要来源，在苹果中已被证实与花色变异和采收期相关，但其在果实早期发育中的作用研究有限。转座子（TE）插入和长链非编码RNA（lncRNA）是植物基因组顺式调控的重要贡献者，TE插入可改变基因表达，已在苹果单性结实、果实大小及柑橘果实着色等性状中得到证实。基于上述背景，研究人员旨在探究果实细胞数量与硬度之间的关系，揭示自然变异如何通过顺式调控机制驱动MdIAA14b等位基因特异性表达，进而影响苹果果实细胞密度和硬度。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过系统的分子遗传学分析，揭示了MdIAA14b调控苹果果实硬度的完整分子机制。首先，利用RNA-seq数据在多个苹果品种果实中检测到MdIAA14b显著的等位基因特异性表达。通过比较'Gala'二倍体参考基因组中两个等位基因的序列，鉴定出启动子区域的9-bp插入和1,636-bp TE插入与ASE相关。双荧光素酶报告实验证实9-bp插入对MdARF1介导的启动子激活至关重要。进一步研究发现，1,636-bp TE插入位于lncRNA_iaa14b基因座内，与lncRNA表达降低和MdIAA14b表达升高相关。基于105份苹果种质资源的基因分型，研究人员将品种分为A/A、A/G和G/G三种基因型，组织学分析显示A/A基因型品种细胞更小、细胞密度更高、果实硬度更大。番茄转基因实验进一步验证了MdIAA14b过表达可增加果实细胞密度和硬度。转录组分析揭示了MdIAA14b调控生长素信号和苯丙烷生物合成相关基因网络。

三、关键技术方法

本研究采用了多项关键技术方法。样本来源包括新乡苹果试验场的苹果材料、温室培养的Micro-tom番茄和本氏烟（Nicotiana benthamiana）。主要技术方法包括：基于RNA-seq数据的等位基因特异性表达分析，利用IGV可视化BAM文件确定等位基因表达偏向；全基因组DNA序列比对与变异检测，通过DNAMAN软件比对两个等位基因序列鉴定SNP和INDEL；双荧光素酶报告实验，在烟草叶片中瞬时表达验证启动子活性和转录因子调控关系；系统发育树构建，采用邻接法分析MdIAA14b与番茄、拟南芥同源基因的进化关系；番茄遗传转化验证基因功能；组织学分析结合ImageJ软件定量细胞参数；RNA-seq和差异表达基因鉴定，利用DESeq分析并开展GO和KEGG富集分析。

四、研究结果

1. 1.
   MdIAA14b在苹果果实中表现出一致的等位基因特异性表达

通过将'金冠'（GD）果实不同发育阶段的基因组重测序读段和RNA-seq读段比对到GDDH13参考基因组，研究人员在MdIAA14b编码区鉴定到一个A/G SNP。利用该多态性区分等位基因转录本，RNA-seq分析显示GD果实中约80%的读段来自A等位基因，仅约20%来自G等位基因，表现出强烈的等位基因偏向。类似的不平衡在'皇家嘎啦'（RG）成熟果实果肉和果皮中同样检测到，并在'华冠'和'华硕'等多个品种中一致观察到，表明MdIAA14b的ASE是不同苹果遗传背景中的普遍特征。

1. 2.
   两个启动子变异可能与MdIAA14b等位基因特异性表达相关

比较'Gala'参考基因组中两个等位基因的基因组序列，鉴定出启动子区域的1,636-bp插入和9-bp插入以及编码区A/G SNP。全基因组测序比对显示'寒富'（HF）为G等位基因纯合，GD为杂合，'红脆宝'（HCB）为A等位基因纯合。双荧光素酶实验表明，含9-bp插入的GD⁺⁹启动子转录活性显著高于不含插入的HF^?9启动子，删除9-bp序列后启动子活性显著降低。表达分析显示MdIAA14b表达水平与9-bp插入的存在正相关。序列分析发现9-bp插入序列CCGACACAA与ARF结合顺式元件ccGACAaaa的共有序列高度匹配，MdARF1可显著激活GD⁺⁹启动子，而对HF^?9启动子无显著激活作用。

1. 3.
   TE插入与lncRNA_iaa14b表达降低及MdIAA14b表达升高相关

1,636-bp插入位于注释为MD16G1206600的基因组区域，编码潜能分析将该转录本归类为lncRNA，命名为lncRNA_iaa14b。序列分析显示该插入两侧存在5-bp正向重复序列，与LTR/Gypsy类转座子具有序列同源性。表达分析揭示lncRNA_iaa14b与MdIAA14b转录本丰度在不同基因型间呈反向关系：G/G基因型缺乏TE插入，lncRNA_iaa14b表达较高而MdIAA14b表达较低；A/A基因型携带TE插入，lncRNA_iaa14b表达较低而MdIAA14b表达较高；A/G杂合基因型两者表达均居中。

1. 4.
   MdIAA14b表达与果实细胞分裂、细胞大小和硬度相关

系统发育分析显示MdIAA14b与番茄SlAux/IAA14b和拟南芥AtAux/IAA14b亲缘关系最近。MdIAA14b表达随果实发育逐渐升高，在10-20周龄果实中显著高于1-6周龄果实。105份苹果种质分为24份A/A、46份A/G和35份G/G三种基因型。组织学分析显示A/A基因型品种细胞更小、细胞密度更高、果实硬度更大，G/G基因型品种细胞更大、细胞密度更低、硬度较小，A/G基因型表型居中。多年表型分析进一步证实A/A品种硬度持续较高而单果重较低。

1. 5.
   MdIAA14b过表达增加番茄果实细胞密度和硬度

研究人员获得5个35S::MdIAA14b过表达转基因番茄株系，选取OE1和OE2两个独立株系进行详细研究。果实硬度测定显示，15 DAA时转基因系与野生型（WT）相似，但在25、35和45 DAA时显著高于WT。转基因果实果皮更厚、单位面积细胞数更多、平均细胞面积更小，WT果实细胞更大且形状不规则、细胞间隙更多。贮藏实验表明OE2果实皱缩和水分损失显著减少。

1. 6.
   MdIAA14b调控生长素相关基因网络

转录组分析在OE1 vs WT中鉴定出144个上调基因和36个下调基因，OE2 vs WT中鉴定出304个上调基因和82个下调基因，两系共有99个共同上调基因和20个共同下调基因。KEGG富集分析显示差异表达基因富集于苯丙烷生物合成和植物激素信号转导通路。生长素信号相关基因（Aux/IAA、TIR1/AFB、GH3、SAUR）在过表达系中上调，细胞壁修饰基因（扩张蛋白、果胶裂解酶）和苯丙烷生物合成基因表达模式多样，ERF、NAC、WRKY、MYB等转录因子大多在过表达系中表达升高。

五、讨论与结论

本研究发现MdIAA14b作为Aux/IAA家族成员，通过调控细胞数量和单位面积细胞大小介导果实硬度。ASE分析有效鉴定出常规差异表达分析中难以发现的调控变异。9-bp插入包含推定的ARF结合顺式元件，以MdARF1依赖方式增强MdIAA14b转录。TE插入可能通过破坏lncRNA_iaa14b表达间接影响MdIAA14b表达水平。番茄转基因验证支持MdIAA14b在调控果实细胞特征和硬度中的功能保守性。转录组分析揭示MdIAA14b过表达激活生长素响应基因家族，并可能通过促进木质素合成和细胞壁加固增强果实硬度。

研究结论：MdIAA14b表现出与启动子区域两个紧密连锁的顺式调控变异相关的等位基因特异性表达。9-bp插入创造推定的ARF结合位点，与MdARF1响应性启动子活性增强相关；1,636-bp TE插入与lncRNA_iaa14b表达降低及MdIAA14b表达升高相关。携带两种变异的MdIAA14b等位基因表达水平较高，与细胞分裂增加、细胞数量增多、细胞大小减小和果实硬度增强相关。由于9-bp和1,636-bp插入在所分析的品种中紧密连锁，二者对MdIAA14b表达的各自贡献尚无法从当前数据中区分，未来需要对每个变异进行独立及组合的靶向遗传操作以解析其各自功能。