神经元活动调控的组蛋白去甲基化酶KDM7A塑造海马基因表达与行为

《Progress in Neurobiology》：Neuronal activity-regulated histone demethylase KDM7A controls hippocampal gene expression and behavior

　　

神经元活动动态调控赖氨酸去甲基化酶7A（KDM7A）的结合与表达。KDM7A调控神经元和突触可塑性相关基因表达。KDM7A缺陷降低癫痫易感性（seizure susceptibility）。KDM7A缺失产生运动过度（hyperlocomotion）和焦虑样行为（anxiety-like behavior）减少。KDM7A缺陷与任务依赖性认知改变（task-dependent cognitive alterations）相关。

研究背景与问题
赖氨酸甲基转移酶（lysine methyltransferases, KMTs）和赖氨酸去甲基化酶（lysine demethylases, KDMs）在脑发育和成年神经系统中通过调控基因表达发挥关键作用。KDM7A（lysine demethylase 7A，又称KIAA1718或JHDM1D）属于KDM7亚家族植物同源结构域指（plant homeodomain finger, PHF）蛋白，含PHD、JmjC和短卷曲螺旋区；PHD结合甲基化赖氨酸，JmjC催化去甲基化。KDM7A经PHD结合H3K4me₃，去除H3K9me₂/me₁和H3K27me₂/me₁。其双底物特异性受构象变化调控。H3K9me₂去甲基化与组蛋白乙酰化增加及转录激活因子募集相关，提示KDM7A主要作为转录激活因子，并可能通过液-液相分离参与高级染色质组织。KDM7A在鸡、斑马鱼、猪和小鼠胚胎发育中参与神经板、脑发育、Hox基因前后轴模式等，也涉及肿瘤。相比之下，KDM7A在中枢神经系统（central nervous system, CNS）中的作用不清。KDM编码基因突变常与智力障碍（intellectual disability, ID）相关，其旁系同源PHF8（KDM7B）与X连锁Siderius型智力障碍相关；KDM7A罕见错义和无义变异见于脑瘫患者，脑瘫常伴癫痫和认知缺陷。既往小鼠齿状回shRNA敲低Kdm7a导致FOS表达轻度降低、焦虑样行为增加和新物体识别记忆轻度损伤；另一研究提示KDM7A参与吗啡奖赏记忆转录反应。因此，研究人员旨在界定KDM7A在成年脑中的生物学功能。

主要关键技术方法
研究人员整合实验室与公共数据集，包括Allen Mouse Brain Atlas、单细胞RNA-seq、组蛋白翻译后修饰（hPTM）/ChIP-seq、Hi-C和虚拟4C、nuRNA-seq、ATAC-seq、FOS ChIP-seq等；在海马原代培养和海人酸（kainic acid, KA）处理小鼠中验证活性依赖；对2–3月龄雌性小鼠海马进行KDM7A ChIP-seq；由EUCOMM Jhdm1d-tm1a(EUCOMM)Wtsi衍生Kdm7aEn和Kdm7a-KO；对18–20月龄雌性小鼠海马进行RNA-seq；开展免疫组化、RT-qPCR、行为学、KA癫痫易感性及多组学整合。

研究结果
2.1 Kdm7a表达受成熟神经元活动调控（Kdm7a expression is regulated by neuronal activity in mature neurons）
Kdm7a在成年脑多区域表达，海马较高，成年高于胚胎。单细胞RNA-seq显示其在海马兴奋性神经元最强，胶质群体也有表达；Kdm7a启动子富集活跃转录相关标记。KDM7家族中KDM7A在兴奋性神经元表达最高。Hi-C/虚拟4C提示Kdm7a位于约200 kb的拓扑关联结构域（topologically associating domain, TAD），含启动子和候选增强子。KA诱导后Kdm7a转录1 h达峰、6 h回基，伴随染色质可及性、H3K27ac和RNA聚合酶II动态变化；候选增强子结合FOS。雌鼠KA、bicuculline/4AP去极化及脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）处理均可诱导Kdm7a。结论：Kdm7a是活动调控基因，支持其参与神经元可塑性和认知功能。

2.2 海马染色质中KDM7A的结合谱（Binding profile of KDM7A in hippocampal chromatin）
对雌鼠盐水及KA后2 h海马进行KDM7A ChIP-seq。KDM7A占据超过7,000个基因组位点，多数位于启动子。结合区富集H3K4me₃、RNAPII、H3K27ac、CBP和高染色质可及性，H3K27me₃低。相关基因涉及突触组织、树突发育、神经递质受体调控；MGI哺乳动物表型本体术语包括多动、异常行为、空间学习异常、微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic currents, mEPSCs）异常和长时程增强（long-term potentiation, LTP）降低。基序分析最显著富集ETS，提示与ETS转录因子协作；KA后出现590个差异结合区域（differentially bound regions, DBRs）。UP DBRs相关基因富集学习、记忆、认知，AP-1基序富集；DOWN DBRs富集轴突导向和神经元投射，ZIC基序富集。结论：KDM7A主要在活跃启动子发挥作用，ETS参与稳态占位，AP-1参与刺激依赖重分布。

2.3 生成Kdm7a敲除和亚效等位基因株（Generation of Kdm7a knockout and hypomorphic strains）
研究人员用EUCOMM“knockout-first”策略生成Kdm7a敲除。Jhdm1d-tm1a(EUCOMM)Wtsi与CRE删除株杂交后意外产生两种Kdm7a相关转录本，其中En2剪接受体序列在框内保留，导致N端38个氨基酸被替换，缺失exon 3编码的氨基酸94–113，该linker区影响去甲基化特异性；该株称为Kdm7aEn，为亚效等位基因。小队列行为显示Kdm7aEn可存活、无明显异常；开放场中心时间减少，高架十字迷宫（elevated plus maze, EPM）有焦虑样行为减少趋势；莫里斯水迷宫（Morris water maze, MWM）空间学习无显著差异；背景恐惧条件化（fear conditioning, FC）冻结减少，72 h达显著。结论：部分KDM7A功能缺失足以引起运动和焦虑相关表型。研究人员随后用FLP和CRE删除株产生无LacZ盒的常规Kdm7a-KO。

2.4 成年脑总KDM7A消融的影响（Impact of total KDM7A ablation in the adult brain）
Kdm7a-KO缺失exon 3，exon 2与4融合，预测产生仅94个氨基酸、无催化活性的截短蛋白。RT-qPCR确认exon 3有效删除，总转录或截短转录稳定性无显著降低；免疫染色和ChIP-seq确认KDM7A蛋白及染色质占据缺失。KO不影响胚胎存活力，成年外观、体重和SHIRPA一般行为正常。海马无 gross 解剖异常，NeuN神经元密度和parvalbumin中间神经元数量无差异；星形胶质细胞数量轻度显著减少；成年期doublecortin表达未改变。全局H3K9me₂和H3K27me₂无显著变化，提示其他组蛋白去甲基化酶可能代偿。

2.5 Kdm7a-KO海马转录改变（Transcriptional alterations in the hippocampus of Kdm7a-KOs）
对18–20月龄雌鼠海马RNA-seq，9只KO与9只对照，每组3只合并，n=3。主成分分析（principal component analysis, PCA）显示基因型分离。共286个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），187个下调和99个上调，符合KDM7A转录激活因子作用；DEGs在对照海马中通常高表达。KO中exon 3读数缺失，总Kdm7a转录轻度增加；KDM7家族及其他KDM基因中仅Kdm7a显著变化。下调基因富集金属离子和神经递质转运，包括离子通道、轴突导向分子和细胞类型标志物；上调基因富集胞吐、突触组装和发育过程。42%下调DEGs的启动子有KDM7A结合，显著高于随机；上调DEGs也显著但较低（24%）。下调DEGs的KDM7A结合强于上调DEGs。整合单细胞数据提示不同海马细胞群受影响：CA3/CA1锥体神经元、DG颗粒神经元、星形胶质细胞及广泛分布群。与N2A细胞shRNA敲低及PFC shRNA数据重叠有限；与PHF2过表达、Phf8-KO数据有显著重叠，Kdm7a与Phf8-KO共享超过6% DEGs，Wdr6一致出现。结论：KDM7A参与海马细胞类型特异性转录调控，KDM7家族转录程序保守且部分重叠。

2.6 Kdm7a-KO在癫痫易感性降低时仍表现强烈IEG诱导（Kdm7a-KOs display robust IEG induction despite reduced seizure susceptibility）
研究人员分析活动依赖KDM7A招募。KO DEGs处KDM7A结合在KA后未明显改变。但62%获得KDM7A结合的区域与活动调控基因重叠，31%在KA后6 h仍上调；超过6%活动诱导基因直接有KDM7A结合，包括Fos、Arc、Npas4、Bdnf、Nptx2。丢失KDM7A结合的区域中18%与转录降低相关，25%在6 h仍失调，例如C1ql2。18–20月龄雌性Kdm7a-KO经KA处理后推进Racine分期所需时间更长，发作次数更少，死亡率更低，提示对KA诱导癫痫抵抗。基础即刻早期基因（immediate early genes, IEGs）表达无差异；KA后早期和延迟反应基因仍强烈诱导，与对照相当或更高，但对照因反应过强过早死亡或需安乐死，限制直接比较。结论：KDM7A不是这些基因活动依赖诱导的严格必需因子，但参与活动诱导转录并影响癫痫易感性。

2.7 Kdm7a-KO表现活动过度和焦虑样行为减少（Kdm7a-KOs show hyperactivity and reduced anxiety-like behavior）
SHIRPA显示雄性KO自发和运动活动改变。开放场（open field, OF）中两性KO距离更长、区域转换更多，中心时间更多，周边休息更少。EPM中KO开放臂时间和距离增加，尤其雄性，开放/闭合臂转换更多。明暗箱中KO光照区时间更多、暗区更少。大理石埋藏中KO埋藏比例更低，首次埋藏潜伏期更长，挖掘活动减少。强迫游泳（forced swim test, FST）和尾悬（tail suspension test, TST）中KO不动时间更少、首次不动潜伏期更长；因两项均依赖不动，不能与活动过度分离，不能解释为抑郁样行为改变。三室社交测试中两基因型均显示社交偏好，无显著基因型差异，但KO总距离更高。结论：KDM7A参与调节运动活动和焦虑相关行为，不影响社交性；表型在雌雄均见；Kdm7aEn也表现活动过度，提示剂量敏感。

2.8 Kdm7a-KO表现任务依赖性认知改变（Kdm7a-KOs show task-dependent alterations in cognitive performance）
MWM可见平台期无基因型差异；隐藏平台期KO更快到达平台，可能反映游泳速度和活动过度；路径长度在训练后期改善。探针试验PT1中KO目标象限时间更多，但平台区穿越次数相似，空间表现增强证据不确定。Y迷宫交替三元组和总臂进入增加，交替百分比与对照相似，提示工作记忆保留。新物体识别（novel object recognition, NOR）中KO对新物体探索偏好增加，熟悉化阶段相似，但距离和速度更高，可能受活动/焦虑影响。FC中习惯化和pre-tone无差异，KO在cued和contextual测试中冻结显著减少，而基线冻结、电击反应和即时后冻结无差异；Kdm7aEn也显示FC缺陷。结论：KDM7A可能参与认知功能，但结果不支持普遍记忆缺陷或改善，而是任务依赖性表现改变，解释受活动过度、焦虑样行为减少和可能恐惧表达改变限制。

讨论与结论
讨论指出，KDM7A以活动调控方式在神经元表达，参与成年脑表观遗传景观建立和维持。Kdm7a-KO可存活且无明显宏观异常，可能与KDM7家族PHF2、PHF8功能冗余有关。Kdm7a海马表达高于其他脑区，活动后升高，提示海马偏好性作用。转录组显示数百基因依赖KDM7A，涉及可塑性过程；与KDM1A、KDM5C等H3K4去甲基化酶缺失时非神经元基因异位表达不同，KDM7A可能维持神经元基因转录能力。KDM7A富集于可塑性相关基因启动子并在刺激后上调，作为H3K9me₂/H3K27me₂双去甲基化酶，可能维持位点许可状态、降低抑制性甲基化，促进学习或高强度活动时快速诱导；需直接分析KO海马组蛋白修饰验证。KDM7A占据与突触组织、树突发育相关，提示其缺失可能改变突触生理；PHF8和PHF2也调节海马突触可塑性和LTP，需电生理确定。海马参与焦虑和记忆，KO降低KA癫痫易感性、活动过度、焦虑样行为减少；焦虑/应激相关基因Dlk1、Dio3、Oxtr、Vegfd上调及离子通道/活动相关基因失调可能贡献。MWM、NOR、Y迷宫解释受活动过度和焦虑减少限制；FC冻结减少可能反映联想恐惧记忆或表达受损。数据不支持认知普遍改善或损害，而是任务依赖性行为改变；需条件性和诱导性模型区分发育与成年功能，并分离认知与运动/焦虑混杂。与Wang et al.的shRNA结果不同，可能因时间、解剖特异性、耗竭程度、发育代偿、回路和实验条件差异。与PHF8-KO有相似焦虑减少和不动减少，与PHF2记忆特异作用不同。未来恢复KDM7A或诱导rescue可区分可逆成年功能与发育后果，也可能影响癫痫易感性。KDM7A尚未确定与智力发育障碍相关，但其旁系PHF8与MRXSSD相关；KDM7A变异见于脑瘫，首例患者有四肢瘫、智力障碍和癫痫。需要患者遗传和功能研究明确KDM7A变异是否贡献神经发育表型。
研究结论部分翻译：总之，这些结果确立KDM7A是成年大脑中神经元功能和可塑性的重要调节因子。总体而言，这些数据不支持认知的普遍改善或损害，而是揭示任务依赖性行为改变。条件性和诱导性模型将需要用于区分KDM7A的发育功能与成年功能，并将认知效应与运动及焦虑相关混杂因素分离。