Dioon tomasellii（Zamiaceae）南部分布区形态、种群统计历史与适应性分化支持多个进化显著单元

《Conservation Genetics》：Assessing evolutionarily significant units in a widespread species: morphology, demography, and adaptive divergence support multiple lineages in the southern range of Dioon tomasellii (Zamiaceae)

　　

多数苏铁类（cycads）物种的长期生存面临多重挑战，包括栖息地丧失和非法采集。由于缺乏对物种遗传多样性（genetic diversity）的了解以及分类学不稳定，应对这些威胁更加困难。对物种边界和群体遗传结构（population genetic structure）进行全面且一致的评估，对于确保迁地（ex-situ）和就地（in-situ）保护项目成功维持受威胁物种的遗传多样性是必要的。Dioon属（Zamiaceae）几乎为墨西哥特有，仅一种分布于洪都拉斯，且多数物种被列为易危至极危。作为理解Dioon物种进化和保护状况计划的一部分，研究人员测量了墨西哥西部D. tomasellii群体的遗传多样性水平，估算了群体遗传结构及种群统计历史（demographic history）。研究人员还在单变量和多变量分析中比较了群体间形态性状，并将这些与遗传分化模式进行比较。结果表明，这些群体是隔离的，具有相对较高的遗传多样性，且无近交证据。令人惊讶的高私有等位基因（private alleles）水平，以及显著的等位基因和形态分化及局域适应（local adaptation），表明按当前界定，D. tomasellii可能包含多个物种。研究人员将结果与Dioon先前研究比较，并提出未来应开展工作以修订该物种分类学并指导保护努力。

研究背景与问题：明确的分类学和清晰的物种边界有助于界定保护中的进化显著单元（evolutionarily significant units, ESUs），并确定其受威胁等级。表征物种内遗传多样性和结构可估计过去种群统计历史、迁移、近交和适应潜力，有助于改进灭绝风险评估。近期植物保护最佳实践将遗传变异视为种群长期存续和适应性的指标，并作为保护目标。分类学与群体遗传学相互依赖：分类常依赖群体间遗传分化度量，尤其是在隐存种或物种复合体中；而不准确的分类又会影响物种内遗传结构度量。当类群间形态区别细微、而种内特定性状变异又较大时，这些问题最突出。苏铁类约70%的物种被评估为易危或更差，其分类长期动荡。历史上，苏铁物种标签常被用于腊叶标本而不考虑群体水平变异，导致地理相邻但不同的群体被任意归入同一名称。过去十年，许多新类群通过拆分先前物种而被描述，依据遗传结构、形态变异和生态位分化。多数苏铁物种的保护遗传状态未知，不能依赖近缘种推断遗传多样性或设定保护目标。Dioon包含18种，除D. mejiae分布于洪都拉斯外均墨西哥特有；已评估的15个分类单元中，8个濒危、6个易危。研究聚焦D. tomasellii，其曾广义定义并包括从Guerrero到Sonora的群体，现已知先前界定至少包含四个物种：D. tomasellii、D. sonorense、D. vovidesii和D. stevensonii。当前D. tomasellii记录群体限于Jalisco、Nayarit、Sinaloa和西部Durango，呈斑块状隔离分布，多位于Sierra Madre Occidental西坡及Jalisco跨墨西哥火山带，常见于松栎林和热带落叶林。鉴于其广泛而不连续分布，研究人员假设群体间连通性低，可能导致近交和群体分化；并基于野外形态变异怀疑南部群体中存在多个进化谱系。为此，研究人员产生群体水平RADseq数据并测量推定的诊断性叶片性状，以评估遗传结构、遗传多样性、种群统计历史、形态分化和分类学效用。

关键技术方法：研究人员自墨西哥Jalisco和Nayarit六个地点采集D. tomasellii叶组织，每地点18–48个体，包括模式产地；形态分析另含Carrizal共七地点148个体，Carrizal仅用于形态，Rancho Eureka不纳入形态分析。采用RADseq（restriction-site associated DNA sequencing，限制性位点关联DNA测序），在Illumina NovaSeq 6000上测双端150 bp，用Stacks组装，去除细胞器位点和潜在旁系同源，并用pcadapt区分中性位点、非中性位点及含D. holmgrenii外群的中性位点。遗传结构用fineRADstructure、DAPC（discriminant analysis of principal components，主成分判别分析）、Structure和ASTRAL分析；遗传多样性与分化用poppr、hierfstat、mmod、metapop2及AMOVA（analysis of molecular variance，分子方差分析）；种群统计历史与迁移用Bottleneck、BayesAss3和MIGRATE-N；形态用Kruskal-Wallis、Dunn、DAPC和PERMANOVA（permutational multivariate analysis of variance，置换多元方差分析）。

研究结果：
Genetic structure across localities（各地理居群间遗传结构）：K-means聚类在中性和非中性数据集中均发现四个基因组簇。DAPC清楚分开四个中性簇；非中性位点簇较分散但有重叠。Sierra de Quila和Soledad个体各自成簇；Pedro Moreno与Santuario成簇；Rancho Eureka与Miravalles成簇。fineRADstructure显示相同群体内共祖更高，且存在亚结构，可能为亲代-子代或同胞群。Structure分析最佳K=4，对应上述分组，Miravalles与Rancho Eureka、Santuario与Pedro Moreno仅少量混合。ASTRAL物种树同样分开四组，主要四分体局部后验概率为1；以D. holmgrenii为根，Sierra de Quila最先分化，其次Santuario/Pedro Moreno，最后Soledad与Miravalles/Rancho Eureka分化。研究人员据此将Miravalles与Rancho Eureka称为Nayarit群体，将Santuario与Pedro Moreno称为Western Jalisco群体。

Genetic diversity and differentiation（遗传多样性与分化）：中性位点显示中等杂合度，观测杂合度H_O为0.13–0.16，基因多样性H_S为0.14–0.18，无近交证据；各群体私有等位基因比例很高，中性位点为16–25%。非中性位点参数更高，H_O和H_S约为中性估计的两倍，私有非中性等位基因比例为20–35%。中性数据全局固定中等至高，Φ_ST=0.15，G'_ST=0.19；成对G'_ST为0.13–0.25，最高在Sierra de Quila与Soledad之间。全局等位分化A_ST=0.30，成对A_ST为0.29–0.40；Jost's D（D_Jost）全局为0.05，成对为0.03–0.07。非中性数据全局估计与中性相近，涉及Sierra de Quila的成对G'_ST略高，A_ST为0.31–0.41，D_Jost可达中性的两倍，为0.04–0.11。

Demography（种群统计历史）：Bottleneck分析在不同模型和检验间结果混合。在逐步突变模型（stepwise mutation model, SMM）下，四个群体均显著支持近期种群下降。在无限等位模型（infinite alleles model, IAM）下，符号检验仅Nayarit、Sierra de Quila和Soledad显著，标准化差异检验仅Sierra de Quila和Soledad显著。因数据为微单倍型，更接近IAM，研究人员高度确信Sierra de Quila和Soledad过去发生种群下降，Western Jalisco可能发生，Nayarit则不太可能。按地点分析，BayesAss显示多数群体每代迁入比例近零，除Santuario迁入Pedro Moreno为0.261、Miravalles迁入Rancho Eureka为0.268；17个Pedro Moreno个体被鉴定为来自Santuario的上一代迁入者，24个Rancho Eureka个体来自Miravalles上一代迁入者，另有一个来自两代前；Soledad和Santuario各有一个个体来自Rancho Eureka两代前。按基因组簇分析，迁移基本为零。MIGRATE-N估计过去4N_e代迁移者少于1，表明基本无迁移。

Morphological diversity（形态多样性）：基于形态的DAPC将D. tomasellii分为四个有限重叠簇：Western Jalisco与Miravalles一组，Carrizal、Soledad和Sierra de Quila各自成组；Carrizal位于西部簇与Soledad之间。总体正确分配比例为0.67；Sierra de Quila全部正确，后验概率为1.0，其他群体正确比例为0.44–0.74。PERMANOVA表明群体质心显著不同，成对比较均显著。第一线性函数中，叶长、小叶宽和小叶长/宽贡献突出，主要分开Soledad、Sierra de Quila与Western Jalisco、Miravalles；第二线性函数中，叶柄宽、叶柄长、叶宽、小叶弯曲比、镰刀形距离和叶长贡献突出，分开Carrizal和Soledad与其他群体。Kruskal-Wallis显示所有测量性状在群体间显著不同。Sierra de Quila与多数群体差异最多，除Soledad外有11–14个显著差异；Sierra de Quila与Soledad彼此差异最少，仅4个性状差异，并共享较直较短叶、无毛窄小叶、每米更多小叶和最高小叶长/宽比；Soledad叶柄较短宽、小叶更下弯、叶轴更多绒毛。Western Jalisco和Carrizal小叶最下弯，Miravalles居中；Western Jalisco和Miravalles小叶稍具短柔毛、中等镰刀形且叶柄长；Western Jalisco前向小叶角最大；Miravalles小叶间距更大、反曲较少、刺更少；Carrizal叶柄短宽，叶轴一致被绒毛。

讨论部分总结：
Drivers of divergence among populations of D. tomasellii（D. tomasellii群体分化驱动因素）：结果支持两个互补机制。第一，高比例私有中性等位基因和迁移估计表明四个群体间基本无基因流；仅在Nayarit和Western Jalisco内部采样地点间检测到迁移，而这些地点相距1.5–5.5 km，四个群体间距离约100–200 km。苏铁传粉和种子传播机制可能限制基因流：Dioon由象鼻虫传粉，传粉距离有限；大型种子传播也有限，绝大多数种子留在母株附近。近期种群下降不太可能解释现有分化，因为瓶颈约在2N_e–4N_e代前；群体可能长期隔离，或祖先集合群体中已有显著隔离距离。传粉和传播生物学对集合群体连通性的根本限制，可能是墨西哥Dioon物种高空间周转的主因之一。第二，非中性数据集将个体分入与中性数据相同的组，非中性位点的G'_ST、A_ST和D_Jost略高，私有非中性等位基因比例也更高，支持局域适应参与分化。这与先前Dioon研究中生态位保守性驱动近缘类群物种形成的观点形成对比，仍需在整个分布区检验环境与形态相关因素。

Genetic diversity within populations（群体内遗传多样性）：本研究所识别基因组簇/群体具有中等且可比较的中性遗传多样性：等位基因丰富度A平均2.32，范围2.16–2.49；H_O平均0.14，范围0.13–0.16；H_S平均0.16，范围0.14–0.18。与D. holmgrenii使用同类微单倍型的研究相比，等位基因丰富度相似，但H_O和H_S约为其两倍，私有等位基因比例更低。D. holmgrenii也由多个隔离群体组成，但未出现D. tomasellii同等程度的分化。所有D. tomasellii群体近交系数F接近零，尽管至少半数群体可能经历瓶颈且所有群体间无基因流。一个解释是苏铁雌雄异株，较少因自交而发生近交；但低扩散和有限传粉本应产生近缘个体簇。若近缘个体在群体内空间聚集，均匀降低种群大小可能减少密度并使更远缘个体保留，从而不增加近交。苏铁生长缓慢、世代长，瓶颈效应可能延迟，当前近交估计可能反映下降前状态。要检验这一点，需比较经历和未经历近期瓶颈群体的共祖与近交，但目前有两种基因组数据的物种均经历了近期种群下降。

Morphological characterization and differentiation（形态表征与分化）：在确认群体遗传分化后，研究人员测量或计算24个叶片性状，包括Carrizal，排除Rancho Eureka。PERMANOVA确认地点可通过性状组合区分，成对PERMANOVA表明所有群体形态不同；Miravalles与Western Jalisco在线性判别空间重叠但统计差异仍显著。多元测试有助于判断聚类非随机并发展演化趋势假设，但单性状有助于野外鉴定。Sierra de Quila，其次Soledad，在小叶宽、小叶长/宽、小叶背面、 小叶弯曲比及较低程度叶长上，群体内较一致且与其他群体不同。Sierra de Quila具一致薄、无毛、直小叶；Soledad也有薄、无毛小叶但可下弯，更类似西部群体。叶长在东部群体通常较短，但与西部群体低端重叠。考虑到分化历史，分开Sierra de Quila和Soledad与西部群体的性状可能代表祖先性状保留。西部三群体中，Carrizal在DAPC中较独特，但少有完全不重叠性状；叶轴绒毛可能区分Carrizal与Miravalles、Western Jalisco，Carrizal植株叶轴一致被绒毛，而另两者可从无毛到被绒毛。

Taxonomic and conservation implications（分类与保护意义）：Dioon分类仍在修订，其物种分布趋于有限。本研究显示D. tomasellii南部群体确含多个进化谱系，至少Soledad和Sierra de Quila可形态区分；研究人员正在确认这两个群体应被认定为新种。拆分类群会影响保护状态。D. tomasellii当前在IUCN红色名录中因种群下降和栖息地丧失被列为易危。任何分出类群将具有更小种群、更小出现范围（extent of occurrence, EOO）和更少群体，可能提高威胁等级。保护上，这些群体虽隔离且遗传独特，但保留中等遗传多样性，因此各群体应被视为不可替代且保护优先，无论分类如何。潜在的适应性遗传分化意味着失去任一群体都会减少属内生态和系统发育多样性。Sierra de Quila群体位于Sierra de Quila动植物保护区内，Santuario地点位于私人保护区，其余群体位于私人土地，可能受土地清理或其他栖息地变化影响。

Conclusions（结论）：研究人员在此表明，Dioon tomasellii在其分布区南部的群体是隔离的且遗传独特。这些群体含有高比例独特等位基因，其维持可能由于缺乏花粉流和种子传播以及局域适应。此外，研究人员发现其中两个群体，Sierra de Quila和Soledad，在形态上分化，尤其相对于Western Jalisco和Nayarit群体，Carrizal植株居中。值得注意的是，Sierra de Quila占据最独特且狭窄的形态空间，并在系统发育中为最先分化谱系。这强烈表明它可能是一个独立分类单元。未来工作将纳入分布区北半部（即北Nayarit和Sinaloa）的群体，以确定整个分布区分化程度，并进一步评估该分类单元由多个物种组成的可能性。鉴于每个群体中等杂合度和非常高私有等位基因比例，保护每个群体以当前或更高个体数量，对于防止这些群体所代表的遗传、生态和进化多样性丧失是必要的。