马来西亚急性缺血性卒中患者脑血栓微生物组的16S rRNA扩增子测序先导研究

《BMC Neurology》：16S rRNA amplicon sequencing of cerebral thrombi retrieved by mechanical thrombectomy in acute ischemic stroke: a low-biomass feasibility study with exploratory analysis of in-hospital infection

摘要

背景与目的

机械取栓术取出的脑血栓是一种低生物量基质，其微生物内容尚缺乏充分表征，且尚无来自东南亚人群的数据。本研究旨在评估能否从脑血栓标本中获取并处理16S核糖体RNA（rRNA）V3–V4扩增子测序读取数据，并将探索性次要目标设定为考察发生院内感染与未发生院内感染的患者之间扩增子衍生指标是否存在差异。

方法学

本前瞻性观察性单中心先导研究在马来西亚 Putra 大学苏丹阿卜杜勒·阿齐兹沙阿医院（HSAAS）开展，共纳入2023年1月至12月间连续接受机械取栓术的23例急性缺血性卒中（AIS）患者，其中22例提供了用于测序的血栓标本。脑血栓标本经过DNA提取及16S rRNA V3–V4下一代测序（Illumina MiSeq），并以SILVA SSU数据库（138.1版本）为参考，按99%相似度进行基于参考的操作分类单元（OTU）聚类。采用Mann–Whitney U检验、Fisher精确检验和Spearman等级相关比较发生院内感染与未发生院内感染患者之间的扩增子测序指标。所有参与者的入组时感染状态均通过临床记录确认；在同行评审过程中新增的事后敏感性分析排除了入组时已存在感染的1例患者。

结果

中位OTU分配读取比例为0.0086%（四分位距：0.0054–0.0336%），每标本中位OTU分配读取数为53.5（四分位距：24–151），在此数值下种属分配无法与背景噪声区分。12例患者（54.5%）发生院内感染，以医院获得性或吸入性肺炎为主（91.7%）。感染组与非感染组之间OTU分配读取比例（p?=?0.895）、观察到的OTU丰富度（p?=?0.921）及最优势属的分布（所有p?>?0.05）均未发现具有统计学意义的差异；在排除入组时已存在感染患者的事后敏感性分析中，未有任何比较达到统计学显著性，尽管OTU分配读取比例中位差的方向发生了逆转。OTU分配读取比例与观察到的丰富度之间呈现名义上的正性Spearman相关（r?=?0.425，p?=?0.049），但排除单个异常值标本后不再稳健（r?=?0.338，p?=?0.134），且该相关性归因于观察到的丰富度对测序深度的依赖性，而非生物学关系。所有预设计的比较均未得出稳健的统计学显著结果。Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（CPB）复合群是最常观察到的优势属（7/22，31.8%），其次是Escherichia-Shigella（4/22，18.2%）；两者均为公认的试剂相关污染物。

结论

作为首项来自东南亚AIS队列的此类研究，本研究完成了全部22份血栓标本的DNA提取、16S扩增子文库构建、测序及OTU分配，表明可从这种低生物量基质中获取并处理测序读取数据。由于未设置污染对照，本研究并不能证明脑血栓的细菌内容可以被表征。普遍较低的OTU分配读取比例及缺乏阴性对照使种属结果的微生物学解读无法成立。未发现扩增子测序指标与院内感染之间存在关联。需开展更大规模、具有充分统计效能并设严格污染对照的研究，以阐明脑血栓微生物组的临床意义。