基于SPAAC修饰的HRP脂质体的高灵敏光度读出平台技术开发及其在SARS-CoV-2中和抗体检测中的应用

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Development of a highly sensitive photometric readout platform technology using SPAAC-modified HRP liposomes

　　

基于脂质体（liposome）的生物分析利用了脂质体巨大的信号能力及易于表面修饰的特点。光度法（photometric）、电化学法和荧光法检测在其生物分析应用中占主导地位。本研究探讨了利用蛋白质共价修饰脂质体表面对包封酶功能的影响。选择辣根过氧化物酶（HRP）作为包封模型，链霉亲和素（streptavidin）作为表面配体模型。若干偶联试剂对包封HRP的功能产生负面影响。在EDC-sNHS化学中，膜通透性试剂使HRP失活。类似地，当应用无铜点击化学（copper-free click chemistry），特别是应变促进叠氮-炔环加成（SPAAC）时，叠氮功能化脂质导致酶失活，可能通过与HRP的辅基血红素铁配位。相反，采用二苯并环辛炔（DBCO）功能化脂质的反向策略完全保持了HRP活性。在优化条件下，室温仅24 h偶联时间，链霉亲和素偶联效率达到标准水平。包封HRP以310 mM海藻糖（trehalose）和2 mg/mL人血清白蛋白（HSA）稳定，使其在链霉亲和素修饰后可储存长达6个月。通过适配血清中SARS-CoV-2中和抗体检测试验，对载HRP脂质体进行了评价。因此，脂质体表面用SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域（RBD）修饰。具有简单光度检测的RBD修饰脂质体表现出与荧光磺基罗丹明B（SRB）脂质体相似的灵敏度，两种方法强相关（Pearson’s r = 0.987）。因此，HRP脂质体是用于视觉或光度生物分析的可靠平台，提供与荧光方法相似的检测限，使其成为常规实验室和即时检测（point-of-care）应用的理想选择。

一、研究背景与问题

磷脂具有两亲性，在水相中可自发形成球形双层囊泡，即脂质体（liposome）。Bangham and Horne于1963年发现脂质体。其疏水脂酰链向内，极性头基向外接触水相。脂质组成、胆固醇含量、头基电荷和功能化会影响膜流动性、粒径、稳定性、刚性、相行为和弹性等。常用脂质包括胆固醇、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰甘油（PG）。脂质体因高比表面积、大内水体积、生物相容性、可降解性和易于偶联识别元件而用于生物传感，并可包封荧光染料、电化学或化学发光标记、酶、酶底物、金属或放射性同位素，实现多种读出策略。荧光读出灵敏可靠，但样本内源性荧光可导致背景升高和假阳性风险，且仪器昂贵，限制其在小型实验室和即时检测（point-of-care）中的应用。比色/光度检测更简单、快速、成本低，但灵敏度较低。脂质体可包封多个信号分子提供信号放大；包封酶可催化大量底物，进一步放大。已有多种酶包封脂质体报道，包括辣根过氧化物酶（HRP，一种常用报告酶）等。脂质体用于生物分析需表面修饰配体或识别元件，设计需考虑偶联效率、脂质体完整性和稳定性、表面配体功能。对包封酶的脂质体，还需考虑偶联试剂穿透脂双层影响酶活性。已有偶联策略包括EDC-sNHS化学、Michael加成、硫醇-马来酰亚胺、生物素-链霉亲和素和点击化学（click chemistry）。铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）需铜催化剂，铜离子有细胞毒性；应变促进叠氮-炔环加成（SPAAC，一种无铜点击化学反应）使用环张力炔，无需金属，生理条件下反应且无细胞毒性，二苯并环辛炔（DBCO，一种环张力炔）等可加速。F. Schuber团队首次用Cu(I)催化叠氮-炔反应修饰脂质体；后续发现叠氮功能化脂质不如反向策略；SPAAC在脂质体表面通常需数天达到高偶联率。因此，本研究旨在研究蛋白共价修饰脂质体表面对包封酶功能的影响，比较EDC-sNHS与SPAAC，选用HRP为包封模型酶、链霉亲和素为表面配体模型，开发简单的光度读出HRP脂质体，并适配SARS-CoV-2中和抗体检测。

二、研究开展、结论与意义

研究人员制备包封HRP的脂质体，发现标准EDC-sNHS表面修饰会使包封HRP快速失活；SPAAC中若脂质携带叠氮基团也会导致包封HRP长期储存失活，而采用DBCO功能化脂质、蛋白叠氮化的反向策略可完全保持HRP活性。优化后，室温24 h即可达到与标准化学相当的链霉亲和素偶联效率；以310 mM海藻糖和2 mg/mL HSA稳定，可在修饰后储存6个月。将受体结合域（RBD，SARS-CoV-2刺突蛋白中与ACE2结合的结构域）修饰的HRP脂质体用于血清中SARS-CoV-2中和抗体检测，简单光度检测与荧光磺基罗丹明B（SRB，一种荧光染料）脂质体灵敏度相似，二者强相关（Pearson’s r=0.987）。该研究的意义在于提供可靠、可视觉或光度读出的脂质体平台，其检测限可与荧光方法相近，适合常规实验室和即时检测；SPAAC修饰还具灵活性和可适配性。

三、主要关键技术方法

采用薄膜水化法包封HRP，经挤出、尺寸排阻色谱和透析制备HRP脂质体；采用反相蒸发法制备包封SRB的荧光脂质体；以ICP-OES测定总脂浓度，DLS和ζ-电位表征粒径与表面电荷；以OG裂解脂质体后3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB，HRP显色底物）/H₂O₂光度法测定HRP活性；以SPAAC将DBCO功能化脂质与叠氮修饰的链霉亲和素或RBD偶联，并与EDC-sNHS化学比较；以BSA-biotin异质结合实验评价偶联效率；以固定化血管紧张素转换酶2（ACE2，SARS-CoV-2进入宿主细胞的受体）竞争试验检测中和抗体。血清样本为五份混合人血清（IRS41174、IRS45270、IRS46827、IRS56525和IRS57906，来自Innovative Research）。

四、研究结果

（一）EDC-sNHS偶联导致包封HRP失活

研究人员用薄膜水化法制备包封10 μM HRP的脂质体，脂质体稳定且经去垢剂裂解可产生定量光度读出。但用EDC-sNHS化学进行链霉亲和素表面修饰时，包封HRP迅速失去酶活性。逐步检测EDC-sNHS、链霉亲和素、赖氨酸HCl和透析后活性，发现每一步后酶均失活。研究人员推测EDC或sulfo-NHS可穿透脂双层，与包封HRP反应，例如使HRP分子交联或将酶连接到内层羧基，从而改变酶三维结构、交联或底物转化时迁移受限，最终丧失催化活性。Kazenwadel et al.也提出类似可能。

（二）SPAAC中叠氮功能化脂质与DBCO功能化脂质

研究人员制备含cholesteryl-TEG-azide或DPPE-DBCO的可点击脂质体，并用ICP-OES、DLS、ζ-电位和吸光度表征，参数均在标准合成范围。叠氮功能化脂质体的包封HRP在长期储存中持续且显著失活，4周损失93%活性。研究人员认为朝向脂质体内腔的叠氮基团导致失活：叠氮可与酶辅基血红素铁配位，阻断H₂O₂结合及后续TMB氧化，叠氮自由基可能加至辅基meso位；叠氮还抑制HRP与过氧化氢之间的氢供体系统。相反，含DBCO PE的脂质体中包封HRP在12个月内保持全活性；即使室温孵育至96 h及不同缓冲液组成也未损失活性。

（三）包封物组成与储存稳定性

为提高灵敏度，制备含20、50和100 μM HRP的脂质体。较高HRP浓度产生更好的剂量-反应曲线，LOD从14 nM改善至2.8 nM。供应商建议的HRP最高包封浓度为230 μM，提示性能可进一步提高但未研究。早期用2 mg/mL HSA和310 mM蔗糖在TRIS-HCl（pH 7.2）中稳定包封HRP，但偶联后稳定性不足，故优化包封物组成。100 μM HRP与不同HSA浓度组合显示酶高稳定性；超过已用HSA含量无额外益处。SPAAC偶联0.2 mol%链霉亲和素-叠氮后，DLS、ζ-电位和BSA-biotin结合实验确认偶联成功。海藻糖比蔗糖更能维持HRP活性，可能因海藻糖水合体积更大；偶联与对照脂质体差异不显著。但储存超过6个月信号降至40%活性，更高海藻糖达585 mM也未改善。因此，修饰后稳定6个月的最佳包封物为2 mg/mL HSA和310 mM海藻糖溶于TRIS-HCl并含所需HRP。

（四）SPAAC偶联条件优化

研究人员用包封SRB的脂质体优化SPAAC条件，以避免包封酶效应干扰，并与EDC-sNHS比较。链霉亲和素经叠氮修饰（比例1:25）后与含DBCO PE的脂质体孵育。偶联温度4 °C、15 °C、22 °C对点击反应无影响；孵育时间18至96 h有显著影响，室温下深入分析证实。这与Blenke et al.发现一致，即SPAAC在类似脂质体浓度下24 h内未完成。与EDC-sNHS修饰的SRB脂质体比较时，选择室温24 h，链霉亲和素浓度0.2–1.5 mol%。最低蛋白浓度下，SPAAC信号为EDC-sNHS的两倍；最高浓度下仅达EDC-sNHS的67%。研究人员认为这是浓度效应：0.2 mol%链霉亲和素样品中脂质体浓度约3 mM tL，高于1.5 mol%样品的1.2 mM tL。若需更高蛋白表面覆盖，可将孵育时间从24 h延长至96 h。总体而言，SPAAC可高效修饰脂质体，性能与EDC-sNHS相当，无需铜催化。

（五）RBD修饰与ACE2结合

研究人员将SPAAC用于SARS-CoV-2中和抗体检测，表面修饰SARS-CoV-2的RBD。将100 μM HRP脂质体与0–1 mol%叠氮修饰RBD偶联，通过结合固定化ACE2评价。0.05至0.5 mol% RBD增加信号，结合更有效；继续增加导致结合下降，研究人员认为RBD非定向偶联造成表面蛋白拥挤和空间位阻；0.5 mol% RBD结果最佳。为避免RBD叠氮化，也研究将生物素化RBD偶联到1 mol%链霉亲和素修饰脂质体。直接RBD-azide偶联信号比链霉亲和素-生物素化RBD方法高54%。研究人员认为因每脂质体4 mol% DBCO PE高于1 mol%链霉亲和素，结合的生物素化RBD较少；但生物素标签方法对许多蛋白有价值，尤其可进一步优化位点定向固定。

（六）中和抗体检测与血清筛查

为增加灵敏度，制备200 μM HRP脂质体。将100和200 μM HRP脂质体与10 mM SRB脂质体均用0.5 mol% RBD-azide修饰。最低可检测总脂浓度分别为：SRB 6.9 nM，100 μM HRP 1.1 nM，200 μM HRP 0.48 nM，表明HRP光度脂质体可优于SRB荧光脂质体。结合固定化ACE2的LOD分别为：SRB 67 nM，100 μM HRP 51 nM，200 μM HRP 22 nM，验证HRP脂质体与荧光SRB脂质体灵敏度相同；200 μM HRP脂质体比100 μM HRP脂质体LOD低2倍。用多克隆中和抗体PA5-114451作为原理验证，其结合位点在受体结合基序内，可竞争RBD与ACE2结合，故信号-off。HRP脂质体可检测中和抗体：2 μM tL时SRB脂质体EC50为0.042 ± 0.008 μg/mL，HRP脂质体为0.196 ± 0.008 μg/mL。将HRP脂质体浓度降至1 μM tL并将TMB反应时间从10 min延长至30 min，EC50降至0.043 ± 0.004 μg/mL，与SRB脂质体相当。200 μM HRP脂质体不改变EC50（0.048 ± 0.0096 μg/mL），符合EC50取决于抗体及需中和的总RBD量。最后在五种混合人中和血清中测试，200 μM HRP与10 mM SRB脂质体的EC50强相关，Pearson’s r=0.987，表明吸光度酶包封脂质体可可靠替代荧光染料脂质体。

五、讨论部分总结

常规实验室和即时检测诊断通常不具备荧光检测器，因此本研究的总体目标是开发吸光度读出的脂质体，并达到与包封荧光染料脂质体相似的灵敏度。虽然HRP等酶包封于脂质体并非新方法，但标准EDC-磺基-NHS化学表面修饰会导致包封HRP失活。因此，研究人员研究并优化无铜点击反应，以链霉亲和素为模型蛋白。所得外表面修饰链霉亲和素的包封HRP脂质体性能与荧光脂质体相当，并在SARS-CoV-2中和抗体检测中与SRB脂质体比较得到证实。通过包封多个酶和催化大量底物实现双重信号放大，提示吸光度读出脂质体生物分析未来可在不降低灵敏度的情况下替代荧光方法，促进高通量筛选和即时检测，简化分析流程和检测程序。基于SPAAC的修饰提供灵活、易适配的平台技术，可定制检测不同分析物；SPAAC尤其适合位点定向偶联，但需将可点击反应基团引入蛋白结构，例如使用非天然氨基酸。

六、研究结论翻译

将蛋白质和其他生物分子偶联到脂质体表面已很成熟。在生物分析领域，大多数研究使用包封荧光染料的脂质体，以利用高灵敏检测策略及完整与裂解脂质体易分离的优势。然而，常规实验室和即时检测诊断通常没有配备荧光检测器。因此，本研究的总体目标是开发具有吸光度读出的脂质体，使其达到与包封荧光染料者相似的灵敏度。虽然将HRP等酶包封入脂质体并非新方法，但研究人员很快确定，使用标准EDC-磺基-NHS化学对其脂质体表面修饰会导致包封HRP分子失活。因此，研究人员研究并优化了无铜点击反应，使用链霉亲和素作为模型蛋白。所得包封HRP的脂质体在外表面修饰链霉亲和素后，性能与荧光脂质体一样好。这一点在检测SARS-CoV-2中和抗体的实际生物分析中进一步得到确认，并与包封SRB的脂质体比较。测试不同的中和人血清，发现包封HRP和SRB的脂质体结果非常相似（Pearson’s r为0.987）。通过包封多个酶以及通过转化大量底物分子实现的双重信号放大表明，采用吸光度读出策略的脂质体生物分析未来可以在不降低灵敏度的情况下替代基于荧光的方法。这有助于实施各种用于高通量筛选和即时检测技术的生物分析，从而简化分析工作流程和检测程序。基于SPAAC的修饰提供了一种灵活且易于适配的平台技术，可针对各种目标分析物检测进行定制。SPAAC对位点定向偶联策略尤其有吸引力，但需要将合适的可点击反应基团引入蛋白质结构，例如使用非天然氨基酸。总之，这展示了未来多种可能应用。