乙醇诱导可重复沉淀及来自哈拉斯椰枣（Phoenix dactylifera L.）的富α-D-吡喃葡萄糖固体的系统表征

《Foods》：Reproducible Ethanol-Induced Precipitation and Systematic Characterization of an α-D-Glucopyranose-Rich Solid from Khalas Date Fruit (Phoenix dactylifera L.)

　　

摘要 在尝试制备哈拉斯（Khalas）品种椰枣果实（Phoenix dactylifera L.）的乙醇提取物时，从三个独立批次中可重复地获得了一种白色固体沉淀。系统的分析方法确定，分离得到的固体主要由α-D-吡喃葡萄糖（α-D-glucopyranose）以及少量D-果糖（D-fructose）组成。薄层色谱（TLC）表明其具有单糖行为，液相色谱-质谱联用（LC–MS）确认了己糖（hexose）物种的存在，核磁共振（NMR）波谱则确定α-D-吡喃葡萄糖为主要成分，同时为少量D-果糖成分提供了波谱学支持。在鉴定出这两种己糖之后，基于二者相反的旋光度进行的旋光分析，在所应用的二元葡萄糖-果糖模型下估算出其组成为93.8%的D-葡萄糖和6.2%的D-果糖。α-异头质子（H-1）在δ 5.20 ppm处呈现为双重峰（J = 3.5 Hz），这与H-1和H-2之间的轴向-赤道关系一致。在水溶液中的变旋光作用使平衡向热力学上更稳定的β-异头物方向移动，这通过δ 5.20 ppm处α-异头双重峰的相对积分面积减小以及δ 4.62 ppm处β-异头双重峰（J = 8.0 Hz）的相应增加得以证实，后者与H-1和H-2之间的双轴向关系一致。本研究结果证明，无需预先进行水相提取，即可通过乙醇直接诱导从哈拉斯椰枣果实中可重复地分离出富含α-D-吡喃葡萄糖的固体，并对分离材料进行了异头物特异性表征，以及随后在水溶液中的变旋光作用研究。

基于椰枣果实中α-D-吡喃葡萄糖富集组分的乙醇诱导沉淀与系统表征：研究解读

一、研究背景与问题

椰枣（Phoenix dactylifera L.）属于棕榈科（Arecaceae），是一种广泛种植于干旱和半干旱地区的开花植物，其果实被称为“沙漠的面包”，在中东、北非等地是重要的天然能量来源和必需营养素供给者。椰枣果实含有黄酮类、酚酸类和类胡萝卜素等生物活性次生代谢产物，其中许多以糖苷形式存在，因此对单糖（糖苷配基部分，即glycone）组分的表征对于理解椰枣果实中的糖苷类成分具有重要意义。

尽管椰枣果实中糖类组成已被广泛研究，但以往研究大多集中于粗提物中糖类的鉴定与定量，而非将其作为固体直接分离。此前的核磁共振（NMR）研究要么从水相椰枣提取物中分离葡萄糖，要么将干燥的椰枣提取物在含D₂O的缓冲液中复溶后再进行波谱分析，这些条件均允许α/β异头物通过变旋光作用发生相互转化。相比之下，本研究采用无水乙醇进行提取和沉淀，在收集分离固体之前不涉及任何水相步骤，从而能够在后续水相变旋光作用发生之前，考察沉淀所得富葡萄糖组分的异头物特征。

二、研究目的与意义

本研究旨在解决以下关键问题：在复杂的哈拉斯椰枣果实基质中，能否通过无水乙醇直接诱导可重复地沉淀出葡萄糖富集组分，并在无预先水相提取的条件下对该组分进行异头物特异性表征。该研究的意义在于：首次展示了无需预先水相提取即可通过乙醇直接诱导从哈拉斯椰枣果实中可重复分离富含α-D-吡喃葡萄糖的固体，并对其异头物组成及在水溶液中的变旋光行为进行了系统表征，为理解椰枣果实中糖苷类成分的单糖组成提供了新途径。

三、主要技术方法

研究人员采用了多种互补的分析技术对分离得到的固体进行系统表征。薄层色谱（TLC）用于初步比较分离组分与五种标准单糖的迁移行为；液相色谱-质谱联用（LC–MS）在正负离子模式下确认己糖物种的存在；一维和二维核磁共振波谱（包括¹H NMR、¹³C NMR和DEPT-135）在DMSO-d₆和D₂O中分别用于鉴定主要和次要组分并监测异头物比例变化；旋光仪用于测量比旋光度并估算葡萄糖与果糖的相对比例。样本为2016年9月、2017年9月和2021年9月分别购自阿曼马斯喀特当地市场的哈拉斯品种干椰枣果实（Tamer阶段），每个批次取2.0 kg果肉进行独立提取。

四、研究结果

4.1 分离程序在独立批次间的可重复性

研究人员对三个独立批次（2016年、2017年和2021年采集）分别采用相同的乙醇浸提和沉淀程序，每批使用2.0 kg椰枣果肉。三个批次均一致地获得白色组分，分离质量分别为4.013 g、3.897 g和4.145 g，对应产率分别为0.2007%、0.1949%和0.2073%（w/w）。平均分离质量为4.018 ± 0.124 g，平均产率为0.2009 ± 0.0062%（w/w；n = 3）。尽管采集时间跨越五年，但分离质量和百分比产率相当，表明该沉淀过程具有可重复性。

4.2 α-D-吡喃葡萄糖富集组分的分离

在椰枣果肉于乙醇中浸提期间，溶剂逐渐变黄，果肉表面形成白色层，表明可溶性成分成功转移至乙醇相。过滤后，乙醇滤液在室温静置18小时后析出白色固体，这与葡萄糖在乙醇中溶解度低的行为一致。分离所得固体经乙酸乙酯洗涤后，代表性组分的熔点为141–142 °C，略低于文献报道的α-D-吡喃葡萄糖的146 °C。

4.3 TLC分析

薄层色谱将分离组分与五种标准单糖（D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖和D-核糖）进行比较。分离组分在所用TLC条件下呈现单一斑点，其R_f值和颜色与D-葡萄糖最为接近。但D-葡萄糖与D-果糖的R_f值相近，该TLC体系无法可靠区分二者。D-核糖迁移率更高，D-甘露糖和D-半乳糖迁移行为不同。TLC为D-葡萄糖作为主要组分提供了初步定性支持。

4.4 LC–MS分析

LC–MS在正负电喷雾电离模式下进行分析。负离子模式下，去质子化单体[M–H]^?在m/z 179.2处为显著信号（相对丰度60%），与去质子化葡萄糖和果糖（C₆H₁₂O₆，分子量180.0 Da）的预期质量一致；最强峰m/z 359.2归属于[2M–H]^?二聚体。正离子模式下，基峰为m/z 198.1，对应己糖的铵加合物[M+NH₄]⁺。提取离子色谱图（EIC）在m/z 179、198和359处各显示单一尖锐峰，保留时间约0.30 min。LC–MS确认了分离固体中含有己糖物种，但由于D-葡萄糖和D-果糖是构造异构体，LC–MS无法区分二者。

4.5 NMR表征

4.5.1 DMSO-d₆中的¹H NMR

在DMSO-d₆中溶解后立即测量（t₀），谱图以δ 6.16 ppm（J = 3.5 Hz）的双重峰为主，归属于α-D-吡喃葡萄糖的异头羟基质子（OH），另有δ 6.53 ppm（J = 5.5 Hz）的次要双重峰归属于β-异头物。积分得到α:β比为96:4，表明α-异头物在溶解后立即占绝对优势。24小时后（t₂₄），α:β比变为92:8，反映在DMSO-d₆中变旋光作用缓慢进行。

4.5.2 DMSO-d₆中的¹³C NMR和DEPT-135

¹³C NMR谱显示α-D-吡喃葡萄糖的异头碳信号在δ 92.4 ppm，环碳（C-2至C-5）在δ 71–73 ppm区域，C-6在δ 61.4 ppm。另在δ 97.1 ppm处观察到较弱的β-异头碳信号。DEPT-135谱中，异头C-1和环碳C-2至C-5为正信号（CH），C-6为负信号（CH₂）。在δ 63–65 ppm区域观察到两个弱的负CH₂信号，与少量D-果糖组分的两个羟甲基碳一致。

4.5.3 D₂O中的¹H NMR

在D₂O中，初始时间点（t₀）观察到两个明确的异头双重峰：δ 5.207 ppm（H-1α，J = 3.5 Hz）和δ 4.625 ppm（H-1β，J = 8.0 Hz），α:β比为89:11，与DMSO-d₆中观察到的α-富集组成一致。室温静置24小时后，α:β比显著变为34:66，接近文献报道的25 °C水溶液中α:β ≈ 36:64的平衡值。

4.5.4 D₂O中的¹³C NMR和DEPT-135

在D₂O中，两个异头碳信号分别位于δ 98.6 ppm（β）和δ 94.8 ppm（α）。与DMSO-d₆相比，两峰均因水中更强的氢键作用而向低场移动。24小时后，β-异头碳信号显著增强，与¹H NMR确定的α:β = 34:66一致。

4.6 比旋光度和组成分析

商业α-D-葡萄糖标准品的初始比旋光度为+106.5°，18小时后降至平衡值+51.8°，与文献报道的D-葡萄糖水溶液平衡比旋光度（+52.7°）接近。在相同条件下，分离固体初始比旋光度为+92.3°，18小时后逐渐降至稳定的平衡值+43.8°。基于二元葡萄糖-果糖模型，利用D-葡萄糖（+52.7°）和D-果糖（?92.4°）的相反旋光度进行线性组合计算：43.8 = 52.7x + (?92.4)(1?x)，解得x = 0.938，对应估算组成为93.8% D-葡萄糖和6.2% D-果糖，即D-葡萄糖/D-果糖比例约为15.1:1。

五、讨论与结论

研究人员指出，分离所得固体的平衡旋光度低于纯D-葡萄糖，这与少量左旋的D-果糖组分的贡献一致。从食品分析角度看，这种简单的乙醇基程序提供了一种无需色谱纯化即可从复杂椰枣果实基质中直接获得葡萄糖富集组分的途径。研究结论为：通过乙醇直接诱导可从哈拉斯椰枣果实中可重复地分离出富含α-D-吡喃葡萄糖的白色固体，无需预先水相提取；平均产率为0.2009 ± 0.0062%（w/w）；分离材料表现出α-异头物的显著优势，在水溶液中发生变旋光作用向β-异头物方向移动；LC–MS确认己糖物种的存在，NMR鉴定D-葡萄糖为主要成分并提供少量D-果糖的波谱学支持，旋光分析基于二元模型估算组成为93.8% D-葡萄糖和6.2% D-果糖。