《International Journal of Molecular Sciences》：Three Cases of Levodopa–Carbidopa Responsive Nocturnal Akinesis in Male Children of an Inbred Family in Rural Baluchistan, Pakistan
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经过超过九年的随访，研究人员描述了一个来自巴基斯坦俾路支农村地区近亲家系（PKSOK）的三名受累男性同胞，他们表现为与酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）缺乏相关的左旋多巴-卡比多巴反应性夜间运动不能。受累个体还表现出运动里程碑延迟、
经过超过九年的随访，研究人员描述了一个来自巴基斯坦俾路支农村地区近亲家系（PKSOK）的三名受累男性同胞，他们表现为与酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）缺乏相关的左旋多巴-卡比多巴反应性夜间运动不能。受累个体还表现出运动里程碑延迟、轻度智力残疾、言语和精神运动发育迟缓，无癫痫、痉挛状态、小脑性共济失调或日间运动无力。左旋多巴-卡比多巴（100 mg/25 mg）治疗后夜间运动症状显著改善，提示可能存在潜在的多巴胺生物合成障碍。对两名受累同胞（IV:16和IV:18）进行的外显子组测序发现了二十个两者共有的罕见（频率<0.001）纯合编码区变异。然而，与疾病表型的分离分析排除了所有这些二十个变异的潜在致病作用。因此，研究人员将分析范围从编码区变异扩展到非编码区变异，发现TH（酪氨酸羟化酶）调控区中存在一个纯合变异c.-70G>A。该c.-70G>A变异此前已在三项研究中被报道过；然而，本研究是在南亚人群中的首次报告。本研究也扩展了与TH变异相关疾病的表型谱，并强调了在具有非典型但对左旋多巴反应性神经学表型的患者中考虑TH调控区变异的重要性。
研究背景与目的
酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是多巴胺生物合成中的限速酶，催化L-酪氨酸转化为左旋多巴（L-DOPA）。TH缺乏症是一种罕见的常染色体隐性遗传病，估计在欧洲人群中患病率为百万分之一至九（Orphanet，ORPHA:101150），其临床表型异质性显著。既往将TH缺乏症分为两型：A型为婴儿期起病的进行性运动功能减退-强直综合征伴肌张力障碍，对L-DOPA反应良好；B型为新生儿期起病的复杂脑病，对L-DOPA反应欠佳。然而，后续研究发现TH缺乏症的表型谱远超出这两类经典分类，可涉及帕金森样表现、智力残疾、眼睑下垂、动眼危象、震颤、严重运动功能减退、肢体高张力、反射亢进、症状昼夜波动及阵发性嗜睡等。
2015年，巴基斯坦俾路支省偏远农村地区一个近亲家系因两名同胞出现罕见神经学表型而被当地媒体报道。受累个体在夜间出现显著的自主运动功能丧失，而日间功能相对保留。由于这种显著的昼夜症状差异，该家系成员后来被媒体广泛称为“太阳儿童”。第三名年龄小于一岁的同胞当时尚未被诊断出相同病症。此类具有非典型临床表现的罕见家族性疾病仍难以诊断，尤其当表型不完全符合已知孟德尔疾病时。尽管外显子组测序提高了罕见病的分子诊断率，但由于检测非编码区、调控区、结构变异、线粒体及表观遗传致病机制的局限性，仍有相当比例临床特征明确的家族性表型未能得到分子诊断。本研究旨在通过长期临床随访结合系统遗传学筛查，明确该家系的分子病因。
研究方法
研究人员经机构审查委员会批准后，对该家系（PKSOK）进行了超过九年的纵向临床和分子研究。主要关键技术方法包括：
- 1.
家系纳入与临床评估：从巴基斯坦俾路支省农村地区纳入PKSOK家系，对受累个体进行全面的神经学、形态学、行为学、眼科、听觉、骨骼及皮肤科评估，采集外周血样本并获得书面知情同意。
- 2.
外显子组测序（exome sequencing，ES）：在美国马里兰大学完成。使用Nimblegen SeqCap EX Exome v2.0文库进行外显子富集，在Illumina HiSeq 4000平台产生约1亿条双端100碱基读长。原始数据经Genome Analysis Toolkit处理，使用Burrows-Wheeler Aligner比对至人类参考基因组GRCh37/hg19。通过内部定制流程筛选两名受累同胞（IV:16和IV:18）共有的候选变异。
- 3.
非编码区变异分析：使用Franklin工具针对神经递质疾病相关基因（HP:0001939）进行分析，以识别非编码区变异。
- 4.
Sanger测序验证与分离分析：使用Primer3设计引物，对所有参与家系成员的DNA样本进行Sanger测序，确认候选变异在家系中的共分离情况。
研究结果
2.1 临床表现与随访
三名来自近亲巴基斯坦家系的男性同胞，在最近一次评估时年龄分别为9岁、17岁和21岁，均于儿童期起病，表现为夜间运动不能。该夜间表现的特征为自主运动活动显著减少，伴有全身肌肉无力和肌张力低下，而非孤立的运动不能。颅神经检查显示部分运动功能丧失。受累个体在夜间发作期间及日间检查时均保持定向力正常，感觉功能和腱反射正常。肌力、自主运动和肌张力在日间或夜间口服左旋多巴-卡比多巴（100 mg/25 mg）后改善。治疗前和治疗后均进行了神经学评估，观察到运动功能改善，未见不良反应。
所有三名个体的病情均在出生后第一年内开始，表现为傍晚嗜睡状态。受累个体直至2岁后才学会行走。夜间发作期间，其言语变得缓慢，轴性肌肉出现明显无力，导致无法坐立和抬头。临床病史和评估提示轻度智力残疾，基于日常适应性功能和纵向临床观察，但未进行正式标准化心理测量评估。无复视、吞咽困难、不自主运动或出生窒息史。夜间，同胞依赖照料者进食和排便。无癫痫、共济失调、大便或尿失禁史。多年来无力逐渐加重，最年长者受影响最重。无眼睑下垂、眼外肌麻痹或腭麻痹证据。儿童无发热，但四肢温暖潮湿。一般体格检查正常，其他器官无明显异常。无呼吸窘迫证据，腹部和心血管检查无异常。晨间进行的运动前后肌电图（electromyography，EMG）无异常，重复神经刺激未见递减反应。其他检查，包括全血细胞计数、血清生化、神经传导研究、计算机断层扫描（computed tomography，CT）和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI），均无异常。抗胆碱酯酶抗体和抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）检测阴性，腾喜龙试验亦无改善。鉴别诊断包括遗传性肌张力障碍、重症肌无力和周期性麻痹（包括低钾性周期性麻痹）。引人注目的是，低剂量左旋多巴给药后症状改善，目前通过规律使用左旋多巴控制症状。
根据家系图谱的遗传模式，研究人员在分析两名受累个体（IV:16和IV:18）的外显子组测序数据时同时考虑了常染色体隐性和X连锁隐性遗传模式。采用读段深度≥4、等位基因频率<0.001、CADD评分≥10及非同义变异的标准，发现两个样本共有二十个编码区变异。所有变异均对所有参与家系成员的DNA样本进行了Sanger测序，但无一变异与夜间运动不能表型共分离，从而排除了其致病可能性。随后，研究人员调查了神经递质疾病相关基因的非编码区变异，发现TH（酪氨酸羟化酶）调控区中存在一个此前已被报道的纯合变异c.-70G>A。然而，通过脑脊液L-DOPA、高香草酸（homovanillic acid，HVA）和5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）检测TH缺乏的生化学检测未能进行，因为家系不同意腰椎穿刺。此外，血浆和尿液儿茶酚胺及其代谢物检测在当地无法进行。
2.2 方法学
该部分详细描述了家系纳入、临床调查、外显子组测序及分离分析的实验流程，已在上述方法部分概述。
讨论与结论
PKSOK家系的临床特征以显著的日间-夜间运动功能变化为标志。三名受累个体均在出生后第一年内出现症状，傍晚和夜间运动不能进行性加重，需协助完成日常活动，而日间力量、张力和运动相对保留。这种时间模式，加上运动里程碑延迟和神经发育受累，使该表型难以归类于已知的神经学综合征。最初考虑了多种神经肌肉和运动障碍疾病。重症肌无力样疾病因缺乏特征性的眼、面、呼吸和延髓肌无力，电生理学研究正常，且腾喜龙治疗无效而可能性较低。周期性麻痹因发育异常、缺乏特征性钾相关性麻痹模式及随后的治疗反应不符而被排除。尽管考虑了儿童期起病的多巴反应性运动障碍，但受累同胞缺乏通常与经典肌张力障碍相关的持续性肌张力障碍、痉挛状态、齿轮样强直、步态肌张力障碍、锥体外系体征和帕金森样表现，使得临床诊断困难。
对两名同胞外显子组测序数据的系统遗传学调查鉴定出TH基因中一个此前已被报道的纯合调控区变异c.-70G>A。TH编码酪氨酸羟化酶，是儿茶酚胺生物合成中的限速酶，催化L-酪氨酸转化为L-DOPA（多巴胺的前体）。TH缺乏症导致内源性L-DOPA生成降低，影响大脑多巴胺生成。左旋多巴给药绕过这一受损步骤，直接提供L-DOPA，而卡比多巴减少其外周代谢，使更多左旋多巴进入中枢神经系统。由此产生的多巴胺可用性增加改善了黑质纹状体和基底节运动信号传导，从而促进运动启动和运动输出。因此，所有三名同胞夜间运动功能的恢复为分子发现提供了额外的生理学支持。
c.-70G>A变异位于TH调控区的八聚体环磷酸腺苷反应元件（cAMP response element，CRE）内，该元件对TH转录至关重要。该区域的功能研究表明，破坏此CRE会降低基础和cAMP诱导的启动子活性。脱氧核糖核酸酶I足迹法进一步表明，CRE内的变化影响了蛋白质-DNA相互作用，表明完整的CRE对于正常TH转录至关重要。
与既往携带c.-70G>A变异的个体相比，PKSOK家系受累个体显示出表型变异。一名患有严重运动功能减退、强直、震颤和动眼危象的六个月大女婴在L-DOPA给药后症状恢复正常；另一名携带c.-70G>A变异的十八个月大女性患者表现为运动发育迟缓、轻度痉挛状态、足尖行走和发作性眼球上翻，对L-DOPA-卡比多巴反应显著。后者停药导致运动迟缓、表情减少和眼睑下垂，而重新引入低剂量L-DOPA-卡比多巴再次产生极佳的临床反应。因此，PKSOK同胞中观察到的显著改善与已确定的TH相关疾病的L-DOPA反应性一致。
尽管在治疗反应上与既往报告的TH缺乏症病例相似，但PKSOK家系观察到的时间模式仍然独特。受累同胞与更广泛的TH相关疾病谱共享早发、发育迟缓、运动功能减退特征和左旋多巴反应性，但他们并未表现出数名既往报告个体中描述的持续性肌张力障碍、严重强直、震颤、动眼危象、痉挛状态或其他突出的运动异常。虽然TH缺乏症中已有昼夜波动的描述，但在既往携带c.-70G>A变异的个体中未报告过这种模式。因此，PKSOK家系中观察到的显著夜间优势代表了与该调控变异相关的异常表型表现，进一步扩展了TH缺乏症的临床谱。
结论：研究人员在此报告了三名TH缺乏症同胞，其特征为显著的夜间运动不能，日间运动功能相对保留。纯合调控区TH c.-70G>A变异的鉴定和分离，连同对左旋多巴-卡比多巴的显著反应，支持该分子诊断。尽管昼夜波动在TH缺乏症的更广谱系中被认可，但该家系中观察到的显著夜间运动不能在既往描述的c.-70G>A病例中未被报告，突显了与该调控变异相关的表型异质性。因此，这些发现进一步强调了在对左旋多巴-卡比多巴有反应的夜间运动不能患者中考虑TH缺乏症的重要性。
