IndelQuant：面向基因编辑鸡的高性价比扩增子测序分析工作流程

《International Journal of Molecular Sciences》：IndelQuant: A Workflow for Cost-Efficient Amplicon Sequencing Analysis of Genome-Edited Chickens

准确量化成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9诱导的插入缺失(indel)对于鸡基因组编辑研究至关重要，因为低编辑效率和嵌合现象会使靶位点修饰的评估复杂化。现有检测方法常在成本与灵敏度或所需序列信息之间存在取舍。本文介绍IndelQuant，一种成本高效的工作流程，整合了样本特异性条形码PCR、混合扩增子文库构建、基于AdapterRemoval3的读段处理和基于CRISPResso2的插入缺失量化。该流程可提供编辑效率、插入缺失位置、插入缺失大小分布和样本水平突变谱的图形化与表格化汇总。研究人员在TYR基因编辑的DF-1细胞和基因编辑鸡中评估了该工作流程。在编辑鸡中，IndelQuant检测到组织特异性插入缺失信号，大多数低于5%，而阴性对照的背景频率为0至0.03%。这些结果表明，IndelQuant保留了扩增子测序提供的序列水平信息，同时简化了样本处理和分析，为禽类基因组编辑研究中低频率和嵌合插入缺失的常规筛查提供了一种实用方法。

鸡在农业、功能基因组学与生物反应器研究中具有重要地位，但禽类基因组编辑仍面临技术瓶颈。由于鸟类受精卵在输卵管中难以操作，且新鲜鸡蛋含有约40,000–60,000个细胞的多细胞胚盘，常规用于啮齿动物的原核注射方法无法适用。目前禽类编辑主要依赖两条途径：体外培养并移植原始生殖细胞(PGCs)，或直接胚内(in ovo)递送病毒或非病毒载体；前者需要特殊培养体系且存在移植与内源PGCs竞争生殖系定植的问题，后者常导致低效率、嵌合编辑。即便编辑成功，G0动物也多为嵌合体，不同组织和个体间编辑频率差异很大。准确检测低频率、异质性插入缺失(indel)并保留突变序列信息，成为禽类基因组编辑实验中的关键需求。

现有CRISPR诱导indel检测方法在成本与分析分辨率之间存在权衡。T7核酸内切酶I(T7E1)和Surveyor检测成本低、速度快，但难以定量稀有或嵌合indel；基于Sanger测序的TIDE和ICE等方法易于使用，但不太适合高度异质性的样本；扩增子二代测序(NGS)灵敏度和序列分辨率高，但常规流程可能要求昂贵的文库制备、复杂的命令行操作，并需要多个独立工具完成解复用、定量和可视化。为解决这些问题，研究人员开发了IndelQuant v0.1.1，一种用于基因编辑动物靶向indel定量的成本高效工作流程。IndelQuant整合样本特异性条形码PCR、混合扩增子文库构建、AdapterRemoval3解复用和CRISPResso2定量，并提供图形参数配置、自动输出监控、结果解析、可视化和CSV导出。研究先在TYR编辑的DF-1细胞中与T7E1和克隆Sanger测序进行验证，再应用于经腺病毒CRISPR-Cas9递送产生的TYR编辑嵌合鸡。该研究提供了一个实际用例：以简化流程替代传统扩增子NGS，用于检测编辑鸡中的低频率和嵌合indel，降低单样本成本和分析负担。

主要关键技术方法如下：研究人员使用融合引物，在正向和反向目标特异性引物5′端加入6-nt独特条形码；6个正向条形码与6个反向条形码组合可标记最多36个样本，混合为一个扩增子文库，经Illumina NovaSeq 6000平台进行PE250或PE150测序。测序读段先用AdapterRemoval3完成基于条形码的解复用、质量过滤、修剪和双端读段连接，再用CRISPResso2 v2.3.4进行参考引导比对和indel定量。IndelQuant基于Python实现，使用CustomTkinter构建图形界面，并整合环境检查、自动输出监控、可视化与CSV导出。样本来源包括ATCC来源的DF-1细胞，以及北京油鸡和信阳黑鸡等动物组织。

研究结果如下：

2.1 开发用于低成本条形码扩增子测序的IndelQuant：研究人员通过合成含独特6-nt条形码的融合引物，将多个样本混合到一个测序文库中，同时保留样本身份。IndelQuant将输入文件选择、条形码表配置、AdapterRemoval3执行、CRISPResso2参数设置、自动运行监控、依赖环境检查、结果解析、图形可视化和CSV导出集成于统一界面。处理流程先用AdapterRemoval3进行条形码解复用、去除未分配或未配对读段、修剪及双端读段连接，再用CRISPResso2进行参考引导比对和indel定量，最终输出编辑效率、indel位置分布、indel大小分布和样本水平突变谱。

2.2 在TYR编辑DF-1细胞中的验证：研究人员用四条TYR靶向gRNA编辑DF-1细胞，IndelQuant估计的编辑效率分别为61.27%、56.25%、77.09%和29.75%。突变谱显示indel富集在预测gRNA切割位点附近，主要indel大小为?5至+1 bp。T7E1检测效率分别为27.2%、42.5%、33.7%和25.8%；克隆Sanger测序也确认了编辑存在。三种方法识别出相同的编辑组，但IndelQuant提供了读段水平定量以及indel位置和大小分布，对异质性样本的刻画更为详细。

2.3 在基因编辑鸡中的应用：研究人员将IndelQuant应用于经两种腺病毒CRISPR-Cas9递送策略（出生后颈静脉注射和胚胎期背主动脉注射）产生的TYR编辑嵌合鸡。非靶向对照组织中观察到的背景indel读段频率为0至0.03%，该值为观察到的对照背景，并非经验证的检出限或定量限。在此背景下，TYR编辑鸡表现出可变indel频率，部分动物的肝、脾等组织较高；胚胎期注射组中，鸡8407、14625和8409在特定组织显示较高indel读段频率。IndelQuant可在多只鸡、多个组织间汇总indel频率，同时保留突变序列供进一步检查。

2.4 基于文献的CRISPR诱导indel检测方法比较：研究人员在预设评分框架内比较了八类方法，评价标准包括成本效率、速度、通量、准确度、灵敏度、等位基因鉴定和可视化。结果显示，IndelQuant加权得分最高(97.5/100)，UMI或分子条形码靶向扩增子测序为87.5/100，靶向长读长扩增子测序为75.0/100，IDAA和ddPCR分别为71.5/100和71.0/100，Sanger trace分解、高分辨率熔解分析和qPCR居于中游，T7E1/Surveyor等错配切割法得分最低。这些评分为定性评估，反映所选标准和权重下的方法特征，不应理解为标准化比较实验测得的准确度或灵敏度差异。

讨论与结论：研究人员指出，尽管PGC介导和病毒CRISPR递送使禽类编辑越来越可行，但跨组织检测低频率编辑信号仍是主要挑战；有效的筛查方法应兼具经济性、低频灵敏度、序列变异分辨能力和易解释性。IndelQuant的优势来自条形码多重混合测序，可在保留样本身份的前提下大幅简化建库负担，同时保留NGS的序列水平分辨率。局限包括：IndelQuant仅针对靶向扩增子测序，不用于全基因组脱靶检测；短读长扩增子测序可能遗漏超出扩增区域的长片段indel或大结构变异；测序周期依赖样本提交和测序服务；在新物种、新位点、新条形码组合或新测序批次使用前，应以合适的阴性对照进行验证。研究结论：IndelQuant为基因编辑鸡提供了一种低成本的图形化常规indel分析工作流程，尤其适用于多样本低频率和嵌合indel筛查，同时保留序列水平突变信息；经适当验证后，该流程可推广至其他基因编辑动物系统。