《Journal of Fungi》：Disseminated Mucor indicus Infection in a Heart Transplant Recipient: Complementary Conventional and Sequencing-Based Diagnostic Approaches
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背景：毛霉病（mucormycosis）是一种在免疫受损患者中快速进展且常致命的侵袭性真菌感染。由于显微镜检查和培养敏感性有限，且靶向分子检测可能无法检出罕见的毛霉目（Mucorales）物种，诊断仍具挑战性。病例展示：研究人员报道一例心脏移植受者在接受免疫抑
背景：毛霉病（mucormycosis）是一种在免疫受损患者中快速进展且常致命的侵袭性真菌感染。由于显微镜检查和培养敏感性有限，且靶向分子检测可能无法检出罕见的毛霉目（Mucorales）物种，诊断仍具挑战性。病例展示：研究人员报道一例心脏移植受者在接受免疫抑制治疗和泊沙康唑预防期间发生播散性Mucor indicus感染并累及肺部和大脑的死亡病例。支气管分泌物的初步显微镜检查显示宽大、少分隔菌丝，符合毛霉目特征，而靶向聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）检测持续阴性。随后通过培养、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）和内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）测序实现菌种鉴定。在神经功能恶化后，脑活检的组织病理学检查证实脑受累，ITS测序检出Mucor indicus。基于DNA和RNA的比较宏基因组测序（metagenomic sequencing）识别出毛霉目序列，尽管在广泛组织病理学真菌负荷的情况下，读段丰度仍意外偏低。然而，将宏基因组读段独立比对至包含所有基因组病毒和真菌参考序列的数据库后，Mucor indicus是唯一获得显著评分的病原体。结论：该病例说明，即使存在侵袭性真菌感染的证据，靶向毛霉目PCR仍可能漏检罕见物种。显微镜检查、培养、组织病理学、ITS测序和全面宏基因组分析为播散性Mucor indicus感染提供了互补证据。整合组织病理学、培养及互补分子方法的综合诊断仍对准确诊断侵袭性毛霉病至关重要。
毛霉病（mucormycosis）是由毛霉目（Mucorales）真菌引起的侵袭性真菌感染，在免疫受损宿主中进展迅速、致死率高，尤其是中枢神经系统（central nervous system, CNS）受累时病死率可达50%以上。该病的诊断历来困难：显微镜检查和培养敏感性有限，而靶向聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）通常针对常见毛霉目物种设计，可能漏检罕见物种。此外，测序方法虽已用于临床，但不同分析策略对样本中低丰度病原的检出能力差异尚待探讨。为此，研究人员报道了一例心脏移植受者发生播散性Mucor indicus感染并同时累及肺和脑的死亡病例，旨在展示常规与基于测序的诊断方法在罕见毛霉病中的互补价值。
研究人员对一名50多岁男性心脏移植受者进行了详细诊断。该患者因缺血性心肌病接受心脏移植，术后接受他克莫司、霉酚酸酯和泼尼松龙免疫抑制治疗，并接受复方新诺明和泊沙康唑预防感染。移植后发生急性细胞排斥反应，给予皮质类固醇冲击及抗胸腺细胞球蛋白强化免疫抑制。移植后2周出现发热咳嗽，胸部CT示肺部浸润。支气管分泌物直接镜检见宽大少分隔菌丝，符合毛霉目特征，但靶向毛霉目PCR以及针对多种呼吸道病原的PCR均阴性。真菌培养分离出快速生长的菌落，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）鉴定为Mucor indicus，内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）测序证实该鉴定（与参考菌株CBS 226.29的ITS序列一致性99.8%）。药敏试验显示两性霉素B最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）为0.125 μg/mL，泊沙康唑为2 μg/mL，艾沙康唑>32 μg/mL。尽管立即给予高剂量脂质体两性霉素B，患者仍出现神经功能恶化，影像学示双侧基底节和胼胝体病变。脑脊液检查显示炎性改变，但微生物学及分子检测阴性。第24天脑活检组织病理学检查（Calcofluor白、过碘酸雪夫PAS和Grocott染色）显示真菌菌丝，但培养阴性。患者最终于第35天死亡。
该研究得出了重要结论：靶向毛霉目PCR未能检出罕见的Mucor indicus，而培养、组织病理学、ITS测序和宏基因组分析为播散性感染提供了互补证据。这提示在临床高度怀疑侵袭性真菌感染时，不能因靶向PCR阴性而排除毛霉病，需整合多种诊断手段。
在技术方法方面，研究人员主要使用了以下关键技术：从支气管分泌物和脑活检样本进行真菌培养，并结合MALDI-TOF MS和ITS区Sanger测序进行菌种鉴定；对脑活检组织进行组织病理学特殊染色以直接观察菌丝形态；提取组织DNA和RNA后进行无偏高通量测序（DNA-seq和RNA-seq）。生物信息学分析包括三种互补策略：一是使用BWA-mem2将去人源序列比对至NCBI RefSeq真菌和病毒参考数据库，并采用泊松分布最小覆盖度评分（Poisson-distribution minimal coverage, PMC）结合中位绝对偏差（median absolute deviation, MAD）阈值识别显著物种；二是使用DAMIAN流程进行de novo组装；三是使用Kraken2/Bracken进行k-mer分类。此外，还进行了针对毛霉目及其他病原的靶向PCR检测。样本均来自该心脏移植受者。
研究结果分为两部分。
3.1 临床表现与常规诊断
此部分通过常规微生物学和病理学方法确立了肺部及脑部感染的性质。支气管分泌物培养和MALDI-TOF MS/ITS测序鉴定出Mucor indicus；脑活检组织病理学证实真菌菌丝，符合侵袭性毛霉病。而靶向PCR反复阴性，培养在脑组织中未生长，说明常规方法的敏感性在罕见病原和已用抗真菌药情况下受限。
3.2 分子和宏基因组分析
此部分通过分子测序进一步确认CNS受累。ITS-PCR和测序在脑组织中检出M. indicus DNA。DNA-seq和RNA-seq分别产生145,475,190和90,169,812条读段。去人源后，参考比对在DNA数据中将M. indicus识别为显著离群值（映射读段仅100条），在RNA数据中M. indicus是唯一显著离群值且读段数最高（5750条）。病毒参考序列比对仅检出内源性逆转录病毒等，说明M. indicus是唯一病原。DAMIAN组装也恢复了M. indicus序列，而Kraken/Bracken未能检出毛霉目信号，表明不同分析流程的性能差异。
讨论部分，研究人员总结了该病例的几个关键点：M. indicus感染罕见，主要见于免疫受损宿主；靶向PCR阴性可能源于引物覆盖局限，即使目标属被测序多样性的代表验证，也无法保证覆盖所有罕见物种；CNS毛霉病的脑脊液检测敏感性低，常需脑活检确诊；宏基因组测序中M. indicus读段丰度意外偏低，可能由于真菌细胞壁裂解效率不佳以及RefSeq数据库中M. indicus参考序列长度仅约64 kb，远小于真菌参考中位长度（约26 Mb），因此需采用PMC评分等覆盖度指标而非单纯读段数来判别阳性信号；泊沙康唑预防期间出现突破性感染，分离株对艾沙康唑MIC>32 μg/mL，对泊沙康唑MIC为2 μg/mL，但无临床折点，且未监测血药浓度，不能排除预防暴露不足；尽管早期高强度两性霉素B治疗，患者仍死亡，反映严重免疫抑制和CNS播散的致命性。
研究结论翻译：该病例凸显了靶向分子检测对罕见毛霉目物种的诊断局限性。阴性靶向PCR结果不能排除侵袭性真菌感染。培养和ITS测序确定了肺部菌株的身份，而组织病理学、ITS测序和宏基因组分析为脑受累提供了互补证据。这些发现支持在临床高度怀疑时，应联合常规与基于测序的真菌鉴定方法，以实现准确诊断。
