《Biology》：Transient Pulses and Transcriptomic Rigidity: Dynamic miRNA Expression Patterns in Ovine Ovarian Development Reveal Molecular Strategies Underlying Seasonal Reproduction
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绵羊繁殖力是制约畜牧生产效率的关键经济性状，品种间显著的繁殖策略差异为解析季节性繁殖与高繁殖力的分子机制提供了理想模型。本研究以典型的季节性繁殖、单羔品种乌珠穆沁羊（Ujumqin sheep）为研究对象，采集3月龄（青春期前）、6月龄（青春期启动）和12月龄
绵羊繁殖力是制约畜牧生产效率的关键经济性状，品种间显著的繁殖策略差异为解析季节性繁殖与高繁殖力的分子机制提供了理想模型。本研究以典型的季节性繁殖、单羔品种乌珠穆沁羊（Ujumqin sheep）为研究对象，采集3月龄（青春期前）、6月龄（青春期启动）和12月龄（性成熟）三个关键发育阶段的卵巢组织，进行全转录组测序，系统表征miRNA、lncRNA、circRNA和mRNA在卵巢发育过程中的动态表达轨迹。意外的是，研究人员发现miRNA表达变化并未遵循单调线性轨迹，而是表现出高度非线性的“瞬时脉冲”模式：两两比较显示，3对6月龄和6对12月龄分别有42个和44个差异表达miRNA（differentially expressed miRNAs, DEMs），而3对12月龄仅有21个DEMs，呈“倒V型”分布。通过Mfuzz时间聚类和维恩图交集分析的交叉验证，研究人员锁定了10个核心miRNA，它们在青春期启动窗口期（3→6月龄）同步升高，并在性成熟时（6→12月龄）恢复至基线水平。对这10个miRNA的靶基因富集分析显示，它们显著富集于Wnt、cAMP、FoxO和催产素信号通路，提示这些miRNA与6月龄青春期启动窗口期卵泡发育和激素信号传导相关的分子程序有关。研究人员进一步构建了以这10个核心miRNA为中心的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）调控网络，并解析出两个潜在功能轴：lncRNA MSTRG.20588-miR-211-CTNNB1和circRNA3387-miR-320d-ATG7，直接将瞬时脉冲信号与卵泡优势选择及颗粒细胞质量控制联系起来。一项探索性的品种间比较显示，高繁殖力的小尾寒羊（Small-Tailed Han sheep）在青春期启动窗口期有227个DEMs（约为乌珠穆沁羊的5.4倍），且早期变化大多持续到成年期。相比之下，乌珠穆沁羊在6月龄观察到的大多数差异变化在12月龄被逆转并基本“重置”。基于这些发现，研究人员提出“转录组刚性”与“转录组可塑性”的概念框架来区分这两个品种：乌珠穆沁羊卵巢在完成青春期启动后倾向于将转录组重置为静止状态——这种“刚性”策略可能是季节性繁殖品种的分子标志。总之，本研究为理解绵羊季节性繁殖的分子调控提供了新的概念工具，并为单羔品种繁殖性能的遗传改良提供了潜在的分子靶点。
绵羊繁殖力是制约生产效率和经济效益的核心经济性状。中国地方绵羊品种间繁殖策略差异显著，乌珠穆沁羊（Ujumqin sheep）为典型的季节性繁殖、单羔品种，仅在秋季发情、每年一胎，繁殖效率受限。解析其分子基础对于打破季节性繁殖瓶颈、改良单羔品种繁殖性能具有重要理论和实践意义。卵巢是下丘脑-垂体-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal, HPG）轴的关键效应器官，其发育轨迹决定卵泡储备与排卵能力。非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）特别是微小RNA（microRNA, miRNA）在卵巢颗粒细胞增殖、卵泡发生及类固醇激素合成中发挥重要调控作用。然而，现有研究多局限于单一RNA类型或少数发育阶段，且多采用品种或阶段的横断面比较，难以揭示从青春期前到性成熟的连续动态轨迹；miRNA、长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）、环状RNA（circular RNA, circRNA）与信使RNA（messenger RNA, mRNA）的协调变化，以及特定于季节性单羔繁殖的调控模块仍不清楚。
研究人员以乌珠穆沁羊为对象，采集3、6、12月龄卵巢（每个时间点3只），开展全转录组测序，刻画四类RNA的表达动态。研究发现miRNA表达呈非线性“瞬时脉冲”模式：3对6月龄和6对12月龄分别有42和44个差异表达miRNA（differentially expressed miRNAs, DEMs），而3对12月龄仅21个，呈“倒V型”分布。通过Mfuzz时间聚类和维恩交集交叉验证，锁定10个核心miRNA，其靶基因富集于Wnt、cAMP、FoxO和催产素信号通路。构建竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）网络解析出lncRNA MSTRG.20588-miR-211-CTNNB1与circRNA3387-miR-320d-ATG7两个功能轴。与多羔品种小尾寒羊（Small-Tailed Han sheep）比较显示，乌珠穆沁羊青春期启动期DEM数为后者的约1/5.4，且6月龄的差异变化大多在12月龄被逆转“重置”，而小尾寒羊的早期变化多数持续至成年。据此提出“转录组刚性”与“转录组可塑性”的框架，认为“刚性”可能是季节性繁殖品种的分子标志。该研究为理解季节性繁殖提供了新概念工具和候选靶点。
本研究样本来自吉林省松原市国丰畜禽养殖场的健康母羊（乌珠穆沁羊，每时间点3只，年龄差异±5天，无亲缘关系）；小尾寒羊卵巢sRNA数据来自研究人员先前相同平台测序。主要技术包括：TRIzol法提取总RNA，Illumina NovaSeq 6000（大RNA）和HiSeq 2500（小RNA）测序；HISAT2/StringTie进行转录本组装，CIRCexplorer2与CIRI2联合鉴定circRNA，ACGT101-miR鉴定miRNA；DESeq2与 ANOVA进行差异表达和全局检验，Mfuzz进行时间趋势聚类；TargetScan与miRanda预测靶基因，基因本体论（Gene Ontology, GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析；基于ceRNA假说构建网络并以Cytoscape可视化；实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）验证。
3.1 测序数据质量评估：9个卵巢样本均达到建库要求。大RNA测序共获得7.417亿条原始读段，质控后有效读段7.175亿条，平均Q30为97.89%，参考基因组（ARS-UI_Ramb_v3.0）平均比对率92.96%；小RNA测序获得9971万余条原始读段，质控后8341万余条clean reads，平均Q30 97.13%，长度集中于21-23 nt，5′端具有尿嘧啶偏好，符合miRNA生物发生特征。circRNA以外显子型为主，长度多大于1000 nt。确认数据质量可靠。
3.2 卵巢发育过程中的差异表达动态：两两比较显示，Utm vs Usm得42个DEMs（11上调、31下调），Usm vs Ud得44个（25上调、19下调），Utm vs Ud仅21个（2上调、19下调），呈“倒V型”分布。差异表达circRNA（differentially expressed circRNAs, DECs）分别为178、213、170个；差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNAs, DELs）分别为386、364、432个；差异表达mRNA（differentially expressed mRNAs, DEmRNAs）分别为3616、3629、3538个。维恩分析显示Set1∩Set2有10个DEMs，Set2∩Set3有7个，Set1∩Set3仅1个，三集合交集为0，说明不存在单调连续变化的miRNA，而是多个时间重叠、功能不同的调控模块协同作用。
3.3 Mfuzz时间序列聚类识别“瞬时脉冲”模式：单因素方差分析筛选出59个整体差异显著的miRNA。Mfuzz聚类（c=4）中Cluster 3呈“先升后降”轨迹；c=6时，原Cluster 3进一步分为中等波动（Cluster 3）和大幅波动（Cluster 6）两个子簇。将Set1∩Set2的10个候选miRNA映射至c=6聚类结果，10个（100%）全部归属Cluster 3，验证了其“瞬时脉冲”特征。
3.4 瞬时脉冲核心miRNA靶基因功能富集：对这10个miRNA的靶基因进行GO和KEGG富集，发现显著富集于Wnt、ErbB、FoxO、cAMP和催产素等信号通路，这些通路与卵泡发育、激素合成分泌和排卵调控密切相关，提示它们在6月龄青春期启动窗口期发挥瞬时激活作用。
3.5 ceRNA调控网络构建：以10个核心miRNA为中心，预测并构建了包含154个lncRNA、20个circRNA、9个miRNA和127个mRNA的ceRNA网络。网络拓扑分析显示miR-211、miR-379和miR-320d连接度最高。进一步解析出两个核心轴：lncRNA MSTRG.20588-miR-211-CTNNB1和circRNA3387-miR-320d-ATG7，分别关联卵泡优势选择和颗粒细胞质量控制。
3.6 蛋白互作网络拓扑分析：将靶基因映射至STRING数据库，经置信度过滤后构建102个节点、51对互作的蛋白互作网络（protein-protein interaction, PPI），CTNNB1、YES1和AKT3节点度最高，蛋白水平上支持核心调控基因的枢纽地位。
3.7 品种间比较：与小尾寒羊（1、6、12月龄sRNA数据）比较，小尾寒羊在青春期启动窗口（1→6月龄）有227个DEMs，约为乌珠穆沁羊（3→6月龄42个）的5.4倍；累计变化（基线→12月龄）小尾寒羊330个，乌珠穆沁羊仅21个，相差超过15倍。小尾寒羊早期变化大多持续，而乌珠穆沁羊6月龄的多数变化在12月龄被逆转，且乌珠穆沁羊样本重复相关性更高、PCA组内距离更小，提示其转录组呈“刚性”，小尾寒羊呈“可塑性”。
3.8 RT-qPCR验证：随机选取3个DEMs和3个差异mRNA进行RT-qPCR，表达变化方向与RNA-seq一致，证实测序结果可靠。
讨论部分指出，“瞬时脉冲”模式提示季节性单羔品种的青春期启动并非不可逆的“发育锁定”，而更像一次可逆的“分子试运行”：卵巢完成启动后回到接近青春期的静止状态，以适应非繁殖季节的能量节约。品种间比较支持“转录组刚性”与“可塑性”的划分。ceRNA轴的发现提示核心miRNA通过海绵吸附机制受lncRNA/circRNA精细调控，将miRNA、mRNA和ncRNA整合为功能模块。研究局限性包括：ceRNA关系仅为预测，未经双荧光素酶等功能验证；样本量小（n=3）；按年龄采样且自然光周期下开展，发育年龄与光周期史存在混杂；未直接测定促黄体生成素（luteinizing hormone, LH）脉冲。
结论部分翻译：本研究通过全转录组测序揭示了季节性繁殖、单羔品种乌珠穆沁羊卵巢发育中miRNA表达的“瞬时脉冲”模式。该脉冲在青春期启动窗口激活，至性成熟消退。通过Mfuzz聚类与维恩图交集三重交叉验证，锁定10个核心miRNA，其靶基因显著富集于Wnt、cAMP和FoxO等卵泡发育关键通路。ceRNA网络锚定两个核心调控轴——lncRNA MSTRG.20588-miR-211-CTNNB1和circRNA3387-miR-320d-ATG7，将脉冲信号直接连接至卵泡优势选择和自噬介导的卵泡质量控制。品种间比较显示，多羔品种小尾寒羊在青春期启动窗口的miRNA响应幅度为乌珠穆沁羊的5.4倍，且变化大多持续至成年；乌珠穆沁羊6月龄的分子扰动在成年期被系统性重置。据此提出“转录组刚性”与“转录组可塑性”概念框架：乌珠穆沁羊卵巢在完成青春期启动后倾向于将转录组重置为静止状态，这可能是季节性繁殖、单羔品种的分子标志。该研究为解析绵羊季节性繁殖的分子机制提供了新概念框架和可操作的候选靶点。
