厄瓜多尔南部咖啡采后发酵中可培养细菌多样性的初步评估：基于16S rRNA基因条形码技术

《Fermentation》：Preliminary Assessment of Cultivable Bacterial Diversity During Coffee Post-Harvest Fermentation in Southern Ecuador via 16S rRNA Gene Barcoding

　　

摘要：咖啡的感官特征（organoleptic profile）由微生物介导的发酵过程调控，因此解析咖啡微生物组对精品咖啡产业至关重要。本研究调查了厄瓜多尔洛哈省（Loja）三个咖啡农场，以确定经不同采后处理方法处理的咖啡鲜果（小粒咖啡Coffea arabica var. Geisha）中可培养细菌的多样性。研究人员在肉汤富集步骤后，于胰酪大豆琼脂（Trypticase Soy Agar, TSA）、血琼脂基础培养基（Blood Agar Base）和麦康凯琼脂（MacConkey Agar）上分离细菌。基于菌落形态和革兰氏染色，分离株初步归为14种形态型（morphotypes, MT）。通过16S rRNA基因测序进行分子鉴定，随后进行系统发育分析，并在99%同一性阈值下进行操作分类单元（Operational Taxonomic Unit, OTU）界定。尽管最初聚类得到45株纯化菌株（19株革兰氏阳性，26株革兰氏阴性），但形态学特征显示其与分子工具相比存在显著分类学局限性。分子分析鉴定出9个属和19种细菌基因型，其中乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和肠杆菌属（Enterobacter spp.）是所有处理中最常回收且最具适应性的类群。统计分析（PERMANOVA和PCA）显示，不同采后处理方法（日晒处理或碳浸渍处理）之间以及不同农场之间的细菌群落组成无显著差异，表明在所评估条件下，主要的可培养分离株保持一致。根据文献报道，所回收的多个物种在咖啡发酵中具有功能作用，为未来开发起始培养物（starter cultures）以优化和标准化厄瓜多尔南部咖啡感官品质提供了基线。

厄瓜多尔南部咖啡采后发酵中可培养细菌多样性的初步评估：基于16S rRNA基因条形码技术

一、研究背景与目的

咖啡是全球第二大贸易商品和消费最广泛的饮品之一，小粒咖啡（Coffea arabica L.）在热带和亚热带地区广泛种植，全球年需求量约1050万吨，零售市场年价值超过2000亿美元。在厄瓜多尔，小粒咖啡占全国咖啡种植面积的68%，其中洛哈省（Loja）的咖啡生产以小农户家庭为主，分布于不同海拔梯度和独特微气候条件下，持续产出国际公认的精品咖啡。咖啡品质由独特香气和风味等感官参数决定，这些特性归因于酚类、生物碱、氨基酸、脂质和有机酸等化合物。这些生物活性及芳香前体化合物的积累与转化受农业起源、种植区域、采后处理方法以及最终烘焙动态等因素的连续驱动。采后处理方法（如日晒、水洗、蜜处理、控制发酵或浸渍）直接改变咖啡豆的化学和生物组成，为精品咖啡奠定基础。这些属性可由微生物（主要是细菌和酵母）调控，它们在果肉和粘液发酵过程中进行代谢活动，改变咖啡豆组成并影响最终感官品质。乳酸菌（Lactic acid bacteria, LAB）是这些过程中报道的主要细菌类群之一，作为食品工业关注的重要酶类生产者而突出。

然而，在厄瓜多尔，虽然洛哈咖啡种植园真菌生物多样性的研究已开始，鉴定出酵母属（Saccharomyces）、毕赤酵母属（Pichia）和汉逊酵母属（Hanseniaspora）等，但咖啡果实细菌多样性的研究仍然稀缺，常局限于发酵食品的一般分析。因此，分离和表征当地细菌菌株对于理解其在优化发酵过程中的潜在应用至关重要。本研究旨在从洛哈省三个农场采集的咖啡果实中分离、表型和分子表征并比较潜在功能细菌的多样性。

二、主要关键技术方法

研究人员从厄瓜多尔洛哈省三个不同海拔（2010 m、1500 m和1230 m）的农场手工采集成熟度R5的小粒咖啡变种Geisha鲜果，共27个样本，涵盖日晒（Natural）、室温碳浸渍（Carbonic Maceration, CM）和冷藏碳浸渍（Refrigerated Carbonic Maceration, CRM）三种采后处理方法。细菌分离采用胰酪大豆肉汤（TSB）富集后，在胰酪大豆琼脂（TSA）、血琼脂基础培养基和麦康凯琼脂三种固体培养基上涂布培养。分离株经表型特征（菌落形态、革兰氏染色、过氧化氢酶和氧化酶活性）聚类为形态型（MT）。分子鉴定采用16S rRNA基因扩增（引物27F/1492R）和Sanger测序，通过最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）构建系统发育树，并在99%同一性阈值下进行OTU界定。多样性分析采用Kruskal–Wallis检验、主成分分析（PCA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）。

三、研究结果

3.1 微生物的鉴定与表征

初步获得99株纯菌株，经纯化验证后45株（45.5%）入选详细分析。表型特征揭示14种形态型（MT），其中MT5分支最均一，主要对应分子物种乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），但该分支也包含遗传鉴定为鹑鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）的菌株CM1B7，凸显表型性状在准确判定细菌类群或物种方面的局限性。

3.2 分子鉴定与细菌系统发育

45条16S rRNA基因部分序列经比对，遗传归属为19个分类单元。革兰氏阳性菌包括：鹑鸡肠球菌（1株）、肠球菌属（Enterococcus sp.，3株）、屎肠球菌（Enterococcus faecium，1株）、乳酸乳球菌（12株）和假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides，2株）。革兰氏阴性菌包括：布甘肠杆菌（Enterobacter bugandensis，1株）、肠杆菌属sp1（3株）、sp2（3株）、sp3（1株）、埃希氏菌属（Escherichia sp.，1株）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli，1株）、费格森埃希氏菌（Escherichia fergusonii，2株）、哈夫尼亚菌属（Hafnia sp.，2株）、蜂房哈夫尼亚菌（Hafnia alvei，1株）、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca，3株）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，3株）、克雷伯菌属（Klebsiella sp.，2株）、雷氏普罗威登斯菌（Providencia rettgeri，1株）和液化沙雷菌（Serratia liquefaciens，2株）。革兰氏阳性菌占总数的42.22%，革兰氏阴性菌占57.78%。在99%同一性阈值下，革兰氏阳性菌定义5个OTU，分布于肠球菌属、乳球菌属和明串珠菌属；革兰氏阴性菌定义14个OTU，分布于肠杆菌属、埃希氏菌属、哈夫尼亚菌属、克雷伯菌属、普罗威登斯菌属和沙雷菌属。回收频率上，乳酸乳球菌（12条序列）是革兰氏阳性菌中的优势类群，肠杆菌属（8条序列）是革兰氏阴性菌中最常回收的类群。

3.3 多样性、丰富度与群落组成

Kruskal–Wallis检验显示，不同处理间物种丰富度（χ2 = 5.63，p = 0.059）和Shannon–Weaver指数（χ2 = 1.69，p = 0.428）均无显著差异；不同地点间物种丰富度（χ2 = 0.07，p = 0.965）和Shannon–Weaver指数（χ2 = 0.45，p = 0.796）亦无显著差异。尽管无显著性，但两种创新处理（CM和CRM）相比传统日晒基线对照，细菌丰富度和多样性呈更高的视觉趋势。地点间，洛哈（2010 m）和贡萨纳马（1500 m）的丰富度和多样性高于最低海拔的奥尔梅多（1230 m）。PCA分析中前两维捕获了35.1%的组成方差（PC1，18.0%；PC2，17.1%），CM、CRM和日晒处理样本广泛重叠，质心位于排序原点附近。PERMANOVA确认细菌组成在处理类型间无显著差异（F = 0.703，p = 0.775）。总体而言，可培养细菌组成在不同采后处理方法间相似，观察到的变异反映了个别样本中特定类群回收的差异，而非常温或冷藏碳浸渍的一致效应。

四、讨论与结论

讨论部分指出，洛哈咖啡相关微生物组的表征揭示了远超传统培养方法初步估计的分类复杂性。表型特征与分子鉴定之间的显著重叠印证了形态学方法的局限性，强调必须整合高精度分子工具。16S rRNA基因在属级分辨上有效，但在区分近缘物种时存在固有系统发育局限，如Escherichia coli分支包含Shigella sonnei序列，Hafnia alvei的OTU 11包含Obesumbacterium序列，建议未来采用看家基因（如rpoB）或MALDI-TOF MS蛋白谱分析。研究还发现细菌与真菌多样性不对称，细菌（特别是革兰氏阴性菌）可能具有更强的定殖能力或对采后处理更多样化的生态位响应。革兰氏阴性菌优势类群（肠杆菌科）具有果胶分解和发酵特性，可降解粘液并转化多种化合物，但不受控的活性可能产生过量挥发性脂肪酸或生物胺，导致酸败、洋葱味或哈败味。群落结构的高度一致性表明优势可培养菌株（乳球菌属和肠杆菌属）适应咖啡果实环境，不受发酵配置变化影响。乳酸菌类群中，乳酸乳球菌和假肠膜明串珠菌具有显著生物技术价值，可代谢果糖、降解果胶、产酸和香气挥发物。然而，多种肠杆菌科和肠球菌属类群可能作为机会性人类病原体或卫生指标，不应视为候选起始培养物，未来筛选应聚焦具有安全使用历史的类群（如乳酸乳球菌和假肠膜明串珠菌，GRAS状态），并进行菌株级安全筛选。

研究结论：本研究揭示了洛哈咖啡采后处理相关的分类学上复杂的可培养细菌群落（45株分离株，19种基因型）。16S rRNA条形码有效解析了大多数属，但观察到的表型重叠强调需要多标记整合以实现精确的种级界定。多变量分析证明群落组成具有高度韧性，可培养细菌谱在不同采后处理方法和三个不同海拔农场间保持稳定。这些发现代表经液体富集步骤（TSB）选择的可培养细菌部分，而非实时总微生物演替。尽管如此，这些主要可培养分离株——包括生物技术相关类群如乳酸乳球菌——为区域起始培养物提供了可预测的基线，前提是排除潜在致病类群。奥尔梅多观察到的略低多样性值得未来研究海拔和伴生作物的影响。所有分离基因型已冷冻保存在UTPL培养物保藏中心（Cepario UTPL），为未来受控发酵以评估功能性状、代谢物动态和感官杯测品质保障了本地遗传资源库。