《Horticulturae》：Optimization of Embryo Rescue System for Different Ploidy Crosses and Creation of Triploid Germplasm in Grape
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为进一步提高三倍体胚挽救育种效率并加快无核葡萄新品种选育进程，本研究以6个二倍体和3个四倍体葡萄品种为亲本，配置15个杂交组合，研究采样时间、异常苗挽救及亲本基因型对胚挽救效率的影响，并利用流式细胞术（flow cytometry）对杂交后代进行早期倍性鉴定。
为进一步提高三倍体胚挽救育种效率并加快无核葡萄新品种选育进程，本研究以6个二倍体和3个四倍体葡萄品种为亲本，配置15个杂交组合，研究采样时间、异常苗挽救及亲本基因型对胚挽救效率的影响，并利用流式细胞术（flow cytometry）对杂交后代进行早期倍性鉴定。结果表明，以‘Sweet Scarlet’为母本的杂交组合适宜采样时间为授粉后45 d（days after pollination, DAP）。其中，‘Sweet Scarlet × Jumeigui’组合的胚发育率（20.71%）和成苗率（10.00%）显著高于其他处理。胚萌发结果表明，1535个发育胚中，正常苗占42.67%，异常苗占31.51%，其中‘Jumeigui × Shine Muscat’与‘Ruby Seedless × Jumeigui’的异常苗比例均超过60%。对494株异常苗进行挽救培养，最终获得165株正常植株，平均转化率为33.40%，其中‘Queen Nina × Muscat Hamburg’的转化率最高（66.67%）。利用流式细胞术对10个杂交组合的229株杂种苗进行倍性鉴定，共获得二倍体70株、三倍体51株、四倍体26株及非整倍体82株，三倍体杂种率为22.27%。在本研究所涉及的亲本材料中，以二倍体有核品种‘Wink’为母本的杂交组合，其三倍体杂种获得比例高于以四倍体为母本的组合。最终获得532株成功移栽存活的杂种后代，为无核三倍体葡萄的种质创新和优良品种选育提供了重要的材料基础和技术参考。
**论文解读：不同倍性杂交葡萄胚挽救体系优化与三倍体种质创新研究**
**一、研究背景与科学问题**
无核葡萄因食用方便而备受市场青睐，但当前主流无核鲜食品种多依赖植物生长调节剂诱导获得，天然无核品种占比有限。随着消费者对果品安全和品质要求的不断提升，培育兼具无核、大粒、芳香等综合性状的新型绿色安全无核葡萄品种已成为重要育种方向。胚挽救（embryo rescue）技术是目前创制无核葡萄新种质的主导途径。在常规育种条件下，二倍体与四倍体葡萄杂交形成的合子胚常发生早期败育和胚乳退化，难以自然发育为成熟种子，严重限制了三倍体杂种后代的获得；胚挽救技术可在败育前对未成熟胚进行离体培养，有效克服多倍体杂种胚的发育障碍，显著提高再生植株数量，因此成为三倍体葡萄创制的核心技术手段。已有研究表明，正反交方向可显著影响胚挽救效率和三倍体后代获得率，但相关差异受亲本基因型影响较大，规律尚待系统阐明；同时，针对异常苗挽救对三倍体种质最终获得效率的提升作用研究较少。总体而言，三倍体葡萄育种效率仍然偏低，种质创制效率有待进一步提升。基于此，研究人员开展本研究，旨在优化葡萄三倍体胚挽救技术体系，为三倍体葡萄新品种选育提供优质种质资源和技术参考。
**二、研究内容概述**
本研究以6个二倍体（含无核和有核）和3个四倍体葡萄品种为亲本，配置15个杂交组合，系统研究了采样时间、亲本基因型、正反交效应及异常苗挽救对胚挽救效率的影响，并利用流式细胞术对杂交后代进行早期倍性鉴定。研究期间共收获杂交幼果18193个，剥离胚珠7586个，获得发育胚1535个，平均胚发育率20.23%，共产生植株820株，平均成苗率10.81%。最终532株杂种后代成功移栽存活。
**三、主要关键技术方法**
研究主要涉及以下关键技术环节：其一，田间杂交授粉，于每年5月在陕西省多个葡萄试验基地开展，包括西北农林科技大学曹辛庄葡萄试验农场、渭南市葡萄研究所、眉县葡萄试验站及兴平市农拓葡萄专业合作社等；其二，胚珠离体培养与胚萌发培养，以胚珠发育培养基和胚萌发培养基完成未成熟胚的发育和成苗；其三，异常苗转化培养，将异常苗接种于转化培养基诱导其恢复为正常植株；其四，流式细胞术倍性鉴定，采用BD Accuri C6 Plus流式细胞仪测定亲本及杂种后代叶片DNA相对荧光强度，以二倍体和四倍体亲本作为双重参照判定后代倍性；其五，炼苗移栽，经温室炼苗后将成活植株移植田间。
**四、研究结果**
**4.1 采样时间对多倍体葡萄胚挽救的影响**
针对以‘Sweet Scarlet’为母本的两个杂交组合设置42、45、48和51 DAP四个采样梯度，结果表明‘Sweet Scarlet × Jumeigui’和‘Sweet Scarlet × Queen Nina’均在45 DAP时胚发育率和成苗率最高，其中前者胚发育率达20.71%、成苗率达10.00%，后者分别为7.34%和3.37%。由此确定‘Sweet Scarlet’作母本时45 DAP为适宜采样时间。
**4.2 不同多倍体杂交组合胚萌发结果分析**
1535个发育胚经胚萌发培养后，42.67%形成正常苗，31.51%形成异常苗，25.80%未萌发。异常苗分为单子叶型、双子叶型、有根无芽型、无根苗型、白化苗型和生长停滞型六类。仅有8个组合正常苗比例高于异常苗，其余7个组合异常苗比例显著偏高，其中‘Queen Nina × Sweet Scarlet’异常苗比例高达64.28%，‘Ruby Seedless × Jumeigui’为61.36%且未获得正常苗。
**4.3 多倍体胚挽救异常苗恢复培养**
将494株异常苗接种于转化培养基后，165株成功恢复为正常植株，平均转化率33.40%。‘Queen Nina × Muscat Hamburg’转化率最高（66.67%），‘Queen Nina × Shine Muscat’和‘Sweet Scarlet × Jumeigui’转化率较低，分别为25.00%和25.93%。
**4.4 多倍体葡萄胚挽救结果分析**
不同倍性亲本组合间胚挽救效率差异显著。四倍体‘Jumeigui’作母本时，以二倍体有核品种‘Shine Muscat’为父本的组合胚发育率和成苗率（56.70%、19.58%）显著高于以二倍体无核‘Queen Nina’为父本的组合（16.05%、8.02%）。二倍体有核品种‘Wink’作母本时，以‘Jumeigui’为父本的胚发育率和成苗率（60.45%、47.27%）显著高于以‘Shine Muscat’（22.29%、10.34%）、‘Sweet Scarlet’（13.65%、5.82%）和‘Ruby Seedless’（6.44%、2.04%）为父本的组合。
**4.5 正反交对胚挽救效率的影响**
在4对正反交组合比较中，‘Jumeigui × Sweet Scarlet’的胚发育率和成苗率（46.92%、18.46%）高于‘Sweet Scarlet × Jumeigui’（13.65%、5.82%）；‘Queen Nina × Sweet Scarlet’（9.09%、6.49%）高于‘Sweet Scarlet × Queen Nina’（5.77%、2.82%）；‘Jumeigui × Shine Muscat’（56.70%、19.59%）显著高于‘Shine Muscat × Jumeigui’（22.29%、10.34%）；‘Shine Muscat × Queen Nina’（25.16%、14.50%）显著高于‘Queen Nina × Shine Muscat’（16.05%、8.02%）。结果表明正反交效应显著，母本选择对胚挽救效率具有决定性影响。
**4.6 胚挽救后代倍性早期鉴定**
利用流式细胞术对10个杂交组合229株后代进行倍性鉴定，共获得二倍体70株、三倍体51株、四倍体26株和非整倍体82株，三倍体杂种率为22.27%。以二倍体有核品种‘Wink’为母本的三个组合三倍体率较高，其中‘Wink × Queen Nina’达38.67%、‘Wink × Jumeigui’为20.83%、‘Wink × Chunguang’为17.50%；以二倍体无核品种为母本的组合三倍体率范围为0.00%~11.11%；以四倍体‘Jumeigui’为母本的两个组合三倍体率分别为12.50%和0.00%。
**4.7 胚挽救杂种后代炼苗移栽**
725株杂种F1代经炼苗和移栽，最终532株田间成活，平均成活率73.38%。‘Wink × Jumeigui’成活率最高（98.84%），‘Wink × Chunguang’和‘Wink × Queen Nina’分别为95.12%和72.15%；‘Queen Nina × Sweet Scarlet’成活率最低（10.00%）。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，采样时间的确定需以胚发育达到最大而未发生败育为原则，不同品种适宜采样时间存在差异，本研究中‘Sweet Scarlet’作母本时45 DAP为最优采样时间，但还需多年重复试验验证。异常苗的发生受亲本倍性差异、田间授粉状态、采样时间、培养基成分及离体培养条件等多因素影响，其挽救转化对提高胚挽救效率具有重要意义。亲本基因型主要通过母本效应影响杂种胚发育的微环境，进而决定胚挽救效率和正反交差异；本研究中以二倍体有核品种为母本总体胚挽救效率更优，以‘Wink’为母本尤为突出，但‘Ruby Seedless’与以往报道存在差异，推测与当年花期阴雨天气有关，有待进一步验证。倍性鉴定方面，流式细胞术的检测效率显著优于根尖染色体压片法，但检测到较高比例非整倍体，系多倍体亲本杂交后减数分裂紊乱及染色体异常分离所致。研究还发现，以二倍体有核品种为母本可获得更高比例的三倍体杂种，与部分已有报道不同，可能归因于亲本配合力差异、自花授粉或无融合生殖等因素；部分组合样本量较小，三倍体形成率仅为参考结果，需扩大样本量进一步确证。
研究结论表明，以‘Sweet Scarlet’为母本的杂交组合最适采样时间为授粉后45 d；异常苗挽救可进一步提升多倍体杂种后代的成苗率；亲本基因型显著影响胚挽救后代的获得效率，正反交组合间差异尤为明显；流式细胞术倍性鉴定结果显示，以二倍体有核品种‘Wink’为母本可获得较多的三倍体杂种后代。
