废弃油脂底物重塑生物转化过程中黑水虻幼虫（BSFL）肠道微生物组与生物质组成

《Applied and Environmental Microbiology》：Waste oil substrates reshape the black soldier fly larval gut microbiome and biomass composition during bioconversion

　　

黑水虻幼虫（black soldier fly larvae，BSFL）是泛化分解者，具有将农业和食品加工副产物转化为增值生物产品的潜力，但BSFL在富含脂质的废弃油脂流中的表现以及肠道微生物组在该过程中的作用仍不明确。在此，研究人员评估了BSFL对补充三种化学性质不同废弃油脂的标准鸡饲料日粮的生物转化：酸化植物油（acidulated vegetable oil，AVO）、猪油（pork grease，PG）和废弃食用油（used cooking oil，UCO）。在整个生物转化过程中测定了幼虫性能、生物转化率、肠道微生物组组成、总蛋白和脂肪含量以及脂肪酸谱。幼虫日龄是肠道微生物组结构的主要驱动因素，但废弃油脂补充进一步重塑了群落成员组成和结构，最强的日粮相关效应发生在生物转化早期至中期。多数差异丰度分类单元是基线核心肠道群落成员，表明油脂补充主要改变了驻留分类单元的优势模式。PG和UCO支持幼虫生长，生物转化性能与鸡饲料对照无显著差异，而AVO降低了生物转化率并显示较弱的生长结果。油脂补充还增加了幼虫脂肪含量，降低了蛋白质含量，并使脂肪酸谱向相应油脂原料偏移，尽管幼虫生物质组成仍受基础日粮和宿主或微生物代谢塑造。这些发现表明，选定的富含脂质废弃物流可支持高效BSFL生物转化，同时重塑可能耐受、代谢或间接响应油脂相关条件的驻留肠道微生物组成员，促成幼虫脂质积累和脂肪酸组成的底物依赖性变化。农业和食品加工系统产生大量难以用传统废物增值方法管理的富含脂质副产物。黑水虻幼虫（BSFL）提供了从这些材料中回收营养物质的生物途径，但高效转化取决于底物化学、幼虫生理学和肠道微生物组之间的相互作用。本研究表明，一些废弃油脂流可支持幼虫生长，同时重塑驻留肠道微生物群落并改变幼虫脂肪酸组成。这些发现对农业生物技术很重要，因为它们将BSFL生产框定为宿主-微生物组生物转化系统，而非简单的基于昆虫的废物减量过程。了解肠道微生物如何响应化学性质不同的脂质废物可指导底物选择、预处理和微生物组信息优化策略，将未充分利用的农业和食品加工残留物转化为循环农业系统的增值生物产品。

研究背景方面，黑水虻幼虫（black soldier fly larvae，BSFL）是泛化分解者，在循环生物经济中可将有机废物转化为动物饲料、作物肥料等高值产品，并可在农业残留、食品加工副产物和消费后食物废物等多种有机废物流上发育。其资源利用能力部分与肠道微生物组有关，常规饲养幼虫比无菌幼虫获得更高生物量，肠道微生物组也对日粮高度响应，并可能保留Dysgonomonas、Morganella、Ignatzschineria、Providencia和Enterococcus等核心类群。脂质废弃物流是重要但化学可变的有机副产物，植物油精炼产生皂脚并可转化为富含长链游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）的酸化油，食用油反复加热会促进脂解、氧化和聚合，产生FFAs、极性化合物、醛、酮和聚合酰基甘油，降低油质量并使其难以处理。传统废弃油管理如焚烧、残渣填埋和化学处理常限制增值并造成环境污染，转化为生物柴油又受原料变异、高FFA、预处理需求和供应竞争限制。前期研究直接测试BSFL转化食堂油脂分离器废物，但纯油脂废物日粮严重限制幼虫性能，底物减少可忽略、无化蛹、生物量增益受抑85%、死亡率高达96%，并改变肠道微生物组。因此，需要测试化学多样的废弃油能否作为营养平衡底物中的补充物有效使用。研究人员在标准鸡饲料日粮中补充或不补充三种化学性质不同的废弃油：酸化植物油（acidulated vegetable oil，AVO）、猪油（pork grease，PG）和废弃食用油（used cooking oil，UCO），假设废弃油补充会以底物特异方式重塑BSFL肠道微生物组，偏好假定耐脂或脂相关类群，并通过增加脂质积累和使脂肪酸谱向补充油偏移来改变幼虫生物质组成。研究结论表明，选定的富含脂质废弃物流可支持高效BSFL生物转化，同时重塑驻留肠道微生物组成员，促成底物依赖性幼虫脂质积累和脂肪酸组成变化；这对底物选择、预处理和微生物组信息优化策略具有意义，可将未充分利用的农业和食品加工残留物转化为循环农业系统的增值生物产品。

为开展研究，研究人员从Fluker’s获得BSFL初孵幼虫，从Feed Energy Company获得或制备AVO、PG和UCO。基础日粮为鸡饲料，油按10%质量比例添加，水分调至60%，设三重复，先进行4天nursery阶段，再进行7天生物转化阶段。研究测定幼虫总质量、残余物质量、净幼虫增重、日粮质量损失和生物转化率（bioconversion rate，BCR）。在生物转化第0、2、7天解剖全肠，进行16S rRNA基因V4区扩增子测序，并使用QIIME2、DADA2和Greengenes2等流程分析α和β多样性、PERMANOVA及ANCOMBC2差异丰度。终点采用Folch法提取脂质，Dumas法测氮并换算总蛋白，脂肪酸经酸催化甲酯化后用气相色谱-火焰离子化检测器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）分析。

研究结果方面，幼虫年龄是肠道微生物组分化的主要驱动因素（Larval age is a primary driver of gut microbiome differentiation）。通过16S rRNA基因扩增子测序和PERMANOVA，幼虫年龄解释肠道微生物类群存在与缺失即群落成员组成的最大变异，未加权UniFrac R²=0.25，P=0.001，其次为日粮R²=0.17，P=0.001；在群落结构中，年龄加权UniFrac R²=0.16，P=0.001，日粮R²=0.12，P=0.001。肠道微生物群落在生物转化过程中沿第0天至第2天至第7天的方向性轨迹逐渐分化，最早与最晚时间点分离最大。α多样性显示，系统发育多样性在第0天与第2天之间显著下降并维持至第7天；均匀度从第0天到第2天呈下降趋势，从第2天到第7天显著增加，但第7天与第0天无显著差异；Shannon熵在第2天相对第0天和第7天出现瞬时降低。

废弃油脂底物逐步重塑肠道微生物群落（Waste oil substrates progressively reshape gut microbial communities）。通过按生物转化天数分层的群落分析，日粮间群落成员组成和结构存在差异，多数日粮支持不同肠道微生物群落，但UCO与PG饲喂幼虫的群落结构无显著差异。第0天在指定日粮组间观察到显著群落成员组成差异，但群落结构无显著差异，且bin水平批次效应解释较大变异。随生物转化推进，日粮相关差异更明显，未加权UniFrac中第0天R²=0.14，第2天R²=0.26，第7天R²=0.30；加权UniFrac中第2天R²=0.35，第7天R²=0.25。α多样性受日粮影响不如群落成员和结构一致。纲水平相对丰度显示，BSFL肠道群落在各日粮和时间点均以Actinomycetes、Bacilli和Gammaproteobacteria为主；CF饲喂幼虫第2天Actinomycetes比例从中位数32.22%增至58.21%，而油补充日粮未出现该增加，反而Gammaproteobacteria和Bacteroidia比例增加；第7天所有日粮组Clostridia比例增加。

废弃油脂流对核心BSFL肠道微生物群影响不同（Waste oil streams differentially impact core BSFL gut microbiota）。通过核心特征分析，第0天鉴定出60个扩增子序列变异（amplicon sequence variants，ASVs）为基线核心BSFL肠道微生物群成员。通过ASV水平差异丰度分析比较各油补充日粮与CF对照，共有29个独特ASVs在至少一个油补充处理或时间点差异丰度，其中AVO饲喂幼虫16个，PG饲喂幼虫14个，UCO饲喂幼虫18个；29个中有20个约69%属于第0天核心特征。差异在生物转化第2天最明显，第7天较少ASVs保持差异丰度。Scrofimicrobium、Oceanobacillus、Lederbergia、Proteus、Enterococcaceae、Miniimonas、Staphylococcaceae和Ignatzschineria相关ASVs在油补充日粮中相对较低；Dysgonomonas、Lactobacillaceae和Morganella相关ASVs在油补充日粮中相对较高。若干属包含多个ASVs，在不同日粮和时间点响应不一致，例如Corynebacterium和Dysgonomonas的ASVs并非统一增加或减少。

废弃油脂不显著改变幼虫生长和生物转化性能（Waste oils do not significantly alter larval growth and bioconversion performance）。通过Kruskal-Wallis检验，nursery阶段结束时幼虫生长或生物转化性状无显著差异，尽管bin间存在变异。7天生物转化后，日粮间幼虫质量增益、日粮质量损失或生物转化率也无显著差异。AVO饲喂幼虫倾向于显示较低幼虫质量增益、日粮质量损失和生物转化率，而PG和UCO饲喂幼虫更接近鸡饲料对照，但这些差异无统计学显著性，且重复数少限制检测差异的统计功效。

废弃油脂底物改变幼虫脂肪和蛋白含量并修饰脂肪酸谱（Waste oil substrates alter larval fat and protein content and modify fatty acid profiles）。通过终点营养分析，7天生物转化后幼虫总脂肪和总蛋白含量因日粮而异。油补充日粮幼虫通常脂肪含量较高、蛋白含量较低，但显著成对差异仅见于CF与UCO饲喂幼虫之间。UCO饲喂幼虫脂肪含量最高，为28.6±6.05%，CF饲喂幼虫最低，为8.01±3.00%；CF饲喂幼虫蛋白含量最高，为50.1±0.962%，UCO饲喂幼虫最低，为32.2±2.12%。通过脂肪酸组成分析，幼虫脂肪酸组成因日粮显著变化，R²=0.58，P=0.006；在油饲喂幼虫和油原料中，脂肪酸组成受油身份影响R²=0.39，P=0.004，强于样本类型R²=0.29，P=0.002。油饲喂幼虫脂肪酸谱位于相应原料和CF幼虫之间，显示部分油特异性偏移。CF饲喂幼虫月桂酸C12:0为42.10±2.26%、肉豆蔻酸C14:0为9.04±0.26%，其相对丰度最高；尽管补充油原料中未检测到月桂酸和肉豆蔻酸，油饲喂幼虫仍保留二者但低于CF。AVO和UCO饲喂幼虫富集亚油酸C18:2，与其原料中丰富一致；PG饲喂幼虫棕榈酸C16:0和油酸C18:1相对丰度较高，但原料中升高的硬脂酸C18:0未成比例反映于幼虫。

讨论部分总结：本研究提示，富含脂质的废弃油脂流可以底物特异方式重塑BSFL肠道微生物组成员组成、丰度加权群落结构和幼虫营养组成。幼虫年龄是肠道微生物组分化的主要驱动因素，废弃油补充也改变肠道群落组成，日粮相关效应在生物转化早期至中期最强。然而，微生物重塑并未统一转化为幼虫性能差异。生物转化后未检测到日粮间幼虫生长或生物转化性状的显著差异，但AVO饲喂幼虫倾向于较低幼虫质量增益、日粮质量损失和生物转化率；重复数少限制统计功效并增加II型错误可能，因此结果不应解释为废弃油补充对幼虫生长或生物转化无影响。PG和UCO组与鸡饲料对照在观察性能上相似，提示部分废弃油脂流可能与BSFL系统兼容，同时改变肠道微生物组结构和幼虫生物质组成。油补充虽改变群落组成，但α多样性无一致响应，主要效应涉及群落成员组成和相对丰度变化，提示底物特异性过滤特定肠道群落成员。第0天差异主要为成员组成并伴随强bin效应，提示初始变异可能反映低丰度类群、优先效应或随机定植，随后日粮驱动过滤增强。ASV水平显示，多数底物相关响应涉及基线核心肠道微生物组，油补充改变驻留类群相对成功并促成底物特异周转。ASV响应在属内不一致，提示属水平解释可能掩盖生态意义变异。Dysgonomonas、Corynebacterium和Morganella富集可能反映脂质耐受、对肠道条件改变的被动响应、与其他降解者的间接关联或直接参与脂质转化和营养同化。Ignatzschineria在所有三种油补充日粮中耗竭，尽管常与蝇类和分解环境相关，其一致耗竭可能表明废弃油底物使肠道条件偏离常规分解相关群落。尽管所有油处理均引起微生物响应，幼虫性能因原料而异，提示废弃油效应并非仅由总脂质含量驱动。PG更饱和，AVO更酸且富集FFAs，反复加热的UCO通常含脂解、氧化和聚合产生的降解产物。AVO可能因FFAs富集增加酸度并潜在破坏膜、脂质氧化动态和微生物生长而构成独特挑战；观察到AVO饲喂幼虫爬容器壁而非钻入底物，符合底物回避或应激。未来研究应以更大规模重复实验，并测试AVO能否通过更低添加比例、pH中和或其他预处理更有效利用。营养分析提示油补充通过日粮脂质掺入、宿主代谢和潜在微生物加工改变幼虫生物质。油饲喂幼虫通常脂肪较高、蛋白较低，CF与UCO之间差异最强，提示BSFL生物质可部分反映底物来源脂质，而蛋白含量可能更受幼虫生理或底物宏量营养平衡限制。脂肪酸谱更清楚表明油底物塑造幼虫生物质组成，油饲喂幼虫向相应原料脂肪酸组成偏移，但幼虫谱仍介于油原料和CF幼虫之间，表明生物质组成由日粮输入和生物加工共同塑造。月桂酸和肉豆蔻酸在油饲喂幼虫中持续存在，尽管补充油组分中缺失，可能反映基础鸡饲料、幼虫脂质代谢和/或微生物转化贡献。AVO和UCO饲喂幼虫亚油酸富集，PG饲喂幼虫棕榈酸和油酸富集，表明原料富集脂肪酸掺入；PG饲喂幼虫硬脂酸不完全转移可能反映选择性同化、代谢、氧化或差异保留。亚油酸是人和许多家畜必需ω-6多不饱和脂肪酸，其富集可能与替代食品和饲料应用相关。研究结论翻译：总体而言，本研究强调BSFL生物转化是一种宿主-微生物组农业生物技术，其中富含脂质的农业和食品加工副产物可转化为具有底物依赖性营养谱的昆虫生物质。废弃油脂底物重定向肠道微生物组组装并改变幼虫脂肪酸组成，但底物身份似乎影响这些变化是否与生物转化趋势差异相关。尽管未检测到日粮间幼虫生长或生物转化性状的显著差异，AVO饲喂幼虫持续显示较低性能趋势，表明某些底物化学可能较不兼容高效转化，使用前可能需要优化。这些发现表明，BSFL生产结果由肠道群落可塑性、幼虫生理学和废弃物流化学之间的相互作用塑造，共同影响生物转化性能和最终生物质组成。由于本研究使用16S rRNA基因测序和终点营养分析，未来工作应使用化学定义底物实验分离脂质饱和度、游离脂肪酸、酸度、氧化产物、极性化合物和聚合酰基甘油如何影响幼虫生长、肠道微生物组功能和脂质同化。将这些试验与宏基因组、宏转录组、代谢组和底物优化方法配对，将有助于识别促进高效脂质废物转化的微生物途径和底物特征。研究结果表明，PG和UCO可支持幼虫性能，同时重塑肠道微生物组和宿主脂肪酸组成，更广泛地表明BSFL-微生物组系统可通过将未充分利用的脂质废物转化为增值昆虫生物质，为循环农业生物经济做出贡献。