《Applied and Environmental Microbiology》：A high-throughput pipeline for isolation and screening of the citrus bacteriome identifies Pseudomonas chlororaphis with anti-Candidatus Liberibacter asiaticus activity
编辑推荐：
植物微生物组是次生代谢产物的丰富来源，这些代谢产物常具有抑制病原体或病害的特性。黄龙病（HLB）是一种严重的柑橘病害，目前尚无有效治疗方法。在此，研究人员检验了以下假设：柑橘微生物组中的原生细菌可能对HLB的相关致病菌——亚洲韧皮部杆菌（Candidatus
植物微生物组是次生代谢产物的丰富来源，这些代谢产物常具有抑制病原体或病害的特性。黄龙病（HLB）是一种严重的柑橘病害，目前尚无有效治疗方法。在此，研究人员检验了以下假设：柑橘微生物组中的原生细菌可能对HLB的相关致病菌——亚洲韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter asiaticus, C Las）具有抑制活性。研究人员将机器人微流控分离平台与高通量抗菌筛选测定相结合，利用木虱生防杆菌（Liberibacter crescens）（一种可培养的、作为不可培养的C Las替代菌株）来鉴定具有抗木虱生防杆菌属活性的分离菌株。通过这一流程，研究人员鉴定出35个具有活性的细菌分离株。其中一个强抑制性的柑橘根部分离株——绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis, SRAM11）被选用于生物测定指导的分级分离。研究人员确定，该绿针假单胞菌产生的吩嗪-1-甲酰胺（PCN）是体外抑制木虱生防杆菌的主要驱动因素。研究人员还利用柑橘毛状根离体实验证明了PCN具有显著的抗C Las活性，其效果与土霉素相当。绿针假单胞菌和吩嗪类物质已在其他病害的成功生物防治中得到应用，它们代表了可能应用于缓解HLB的新工具。
研究背景、现存问题与研究目的
柑橘黄龙病（Huanglongbing, HLB）是全球柑橘产业最具毁灭性的病害，在美国每年造成数百万美元的经济损失。该病由一种不可培养的韧皮部专性寄生菌——亚洲韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter asiaticus, C Las）引起，主要通过亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）传播。目前HLB尚无治愈方法，田间管理措施主要依赖媒介昆虫防控、土霉素（oxytetracycline, OTC）注射、种植耐HLB砧木以及营养方案维持树势。然而，OTC注射仅为应急措施，长期使用存在诱导C Las产生耐药性及环境中抗生素耐药基因扩散的风险。因此，开发基于微生物组和天然产物的新型防控策略具有重要意义。植物微生物组是丰富的次级代谢产物来源，其中许多具有抑病特性。此前的研究已从柑橘微生物组中分离出一些具有抗木虱生防杆菌（Liberibacter crescens，C Las最近缘的可培养替代菌株）活性的真菌和细菌，并验证了芽孢杆菌产生的阿米香豆素同时具备抗C Las活性。然而，传统平板培养法分离环境微生物资源消耗大，且倾向于富集快速生长的微生物。本研究旨在评估自动化机器人微流控平台用于柑橘细菌分离的效能，以期缩短分离周期并发现新的抗木虱生防杆菌属目标类群，进而挖掘柑橘原生微生物组中具有抗C Las潜力的生防菌株及其活性代谢产物。
研究方法与技术路线
研究人员采用自动化机器人微流控平台Prospector对来自美国加州大学河滨分校农业试验站的甜橙叶片和根部组织进行细菌分离培养。通过高通量16S rRNA基因扩增子测序对分离物进行批量分类鉴定。随后，建立基于96孔板的高通量抑菌筛选体系，以木虱生防杆菌为靶标菌进行竞争性抑制实验，初筛获得阳性菌株。对阳性菌株进行全基因组测序和平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）分析以确定物种分类。进一步通过液体培养分泌代谢物提取实验验证抑菌活性。针对活性最强的根部分离株绿针假单胞菌SRAM11，采用生物测定指导的分级分离策略，结合正相硅胶柱层析、液相色谱-质谱联用（LC-MS）及核磁共振波谱（NMR）技术鉴定主要活性化合物。最后，利用C Las阳性柑橘毛状根离体实验评价该化合物的体内抗C Las活性。
研究结果
- 1.
微流控平台分离的微生物分类鉴定：从柑橘叶片共回收约860个分离株，归属11个属，优势类群为短小杆菌属（Curtobacterium，70.49%）、泛菌属（Pantoea，14.87%）和假单胞菌属（Pseudomonas，13.16%）。从根部回收约1,092个分离株，归属26个属，优势类群为根瘤菌属（Rhizobium，35.19%）、假单胞菌属（13.78%）和柠檬酸杆菌属（Citrobacter，11.48%）。根部获得的属数多于叶片，符合根际/根面微生物密度高于叶际的规律。
- 2.
高通量抗木虱生防杆菌筛选：通过直接微生物竞争实验，最终获得35株对木虱生防杆菌具有稳定抑制活性的分离株。其中，来自叶片的3株未定种假单胞菌（FA1M10、FA1-1M14、FA1-1M16）的粗提物对木虱生防杆菌的平均抑制率均超过60%，与卡那霉素阳性对照组无显著差异。来自根部的农杆菌属德尔塔变种ARAM2、沙福芽孢杆菌ARAM15和绿针假单胞菌SRAM11的粗提物抑制率均超过50%，同样与卡那霉素对照处于同一统计分组。此外，10个抑制性分离株的ANI值低于95%，表明可能是此前未描述的新物种。
- 3.
绿针假单胞菌SRAM11活性化合物的鉴定：通过生物测定指导的分级分离，从SRAM11粗提物的组分A中鉴定出主要活性成分为吩嗪-1-甲酰胺（phenazine-1-carboxamide, PCN）。合成PCN对木虱生防杆菌表现出剂量依赖性抑制作用，最低抑制浓度为10 μg/mL（44.8 μM）。
- 4.
PCN对C Las的抑制活性：在柑橘毛状根离体实验中，30 ppm的PCN处理72小时后，C Las活菌滴度显著降低，其抑制水平与125 ppm的OTC阳性对照相当，证明PCN是SRAM11发挥抗C Las活性的关键代谢产物。
讨论与结论
假单胞菌属在叶片和根部分离株中均占较高比例，且多数具有强抑制活性，其无细胞上清液仍保持活性，表明分泌组中含有抗木虱生防杆菌化合物。绿针假单胞菌SRAM11是本研究中重点表征的菌株，其产生的PCN是一种具有广谱抗菌活性的氧化还原活性化合物，在多种植物病原细菌和真菌的生物防治中发挥重要作用。值得注意的是，PCN的产生受低氧条件刺激，而C Las定殖的韧皮部正是低氧环境，这提示SRAM11有望在该微环境中递送有效剂量的PCN。此外，HLB伴随严重的须根损失，且前期研究发现随着病情加重，根部镰刀菌等次生病原菌丰度增加，形成病害复合体。SRAM11对柑橘源镰刀菌具有抑制活性，未来需在温室和田间验证其能否通过抑制根部病原菌来缓解HLB症状，特别是须根损失。研究人员得出结论，从柑橘微生物组中成功挖掘到一株绿针假单胞菌SRAM11，其产生的PCN在离体条件下展现出与OTC相当的抗C Las活性，代表了可用于HLB防控的新型微生物资源和天然产物工具。
