祖先序列重建技术设计热稳定性提高的蛋白-谷氨酰胺酶变体

《Applied and Environmental Microbiology》：Design of ancestral protein-glutaminase with improved thermal stability

　　

来源于Chryseobacterium proteolyticum的蛋白-谷氨酰胺酶（protein-glutaminase，PG）是一种在蛋白质脱酰胺方面具有工业价值的酶；然而，其应用因热稳定性不足而受到限制。先前的理性设计研究虽已提高PG的热稳定性，但往往需要劳动密集、逐级优化的策略。本研究采用祖先序列重建（ancestral sequence reconstruction，ASR）在单步设计流程中改造出热稳定性提高的PG变体。共构建了8个祖先PG，其热稳定性相较野生型均有增强。其中稳定性最高的变体AncPG1的熔解温度（melting temperature，T_m）为76.2°C，较野生型高13.6°C。突变剖析鉴定出5个可分别增强热稳定性并在组合后表现出累加稳定效应的氨基酸替换：N148G、N154D、L156Y、L168S和D179S。这些替换主要位于表面相关环区。值得注意的是，尽管祖先变体对小分子合成底物Cbz-Gln-Gly的催化效率降低，但在相同活性单位下进行比较时，它们对大分子蛋白质底物仍保持反应活性。此外，在升高的温度条件下，AncPG1比野生型CpPG（WT CpPG）表现出更高的绝对蛋白质底物反应性。这些发现进一步支持ASR可作为在升温条件下生成具有改善功能性能的热稳定酶变体的一种策略。

蛋白-谷氨酰胺酶（protein-glutaminase，PG）可将蛋白质底物中谷氨酰胺残基的酰胺基转化为羧基，从而改善蛋白质的溶解性、乳化性和起泡性，并降低部分食物蛋白质的致敏性。来源于Chryseobacterium proteolyticum的PG（CpPG）在温和条件下即可高效催化脱酰胺，但该酶在60°C以上迅速失活，热稳定性不足严重限制了其在升温加工场景中的应用。以往基于分子动力学模拟和序列分析的理性设计虽能提升PG热稳定性，却通常需要对候选单点突变进行逐一评估并逐步叠加，实验工作量大，且难以探索广阔的序列空间。为克服这一瓶颈，研究人员采用祖先序列重建（ancestral sequence reconstruction，ASR）策略，在单步设计中引入祖先序列中多重协同的氨基酸替换，以期在不依赖逐步优化的情况下获得高稳定PG变体。研究结果显示，ASR方法成功构建了8个热稳定性均高于野生型的祖先PG变体，其中最稳定的AncPG1熔解温度（melting temperature，T_m）达到76.2°C，比野生型提高13.6°C。AncPG1在70°C下对酪蛋白酸钠、鱼明胶和大豆分离蛋白的绝对脱酰胺活性显著高于野生型CpPG。该研究证明ASR能够从规模较小的文库中高效获得热稳定性显著提升且保留蛋白底物反应性的酶变体，为食品蛋白质高温改性工艺提供了新的工具和设计思路。

研究人员的主要技术方法如下：以NCBI非冗余蛋白数据库为样本来源，使用BLASTP检索同源序列，经冗余及离群序列筛选后保留13条现存同源序列构成序列库；采用MAFFT进行多序列比对（MSA），MEGA11构建最大似然系统发育树，并利用FastML基于Jones-Taylor-Thornton（JTT）模型对8个内部节点进行祖先序列重建。所有PG变体基因经E. coli密码子优化后合成并克隆至pET-29b(+)载体，在E. coli BL21(DE3)中表达，经固定化金属亲和层析（IMAC）纯化。采用以Cbz-Gln-Gly为底物的超高效液相色谱（UHPLC）法测定酶活及热稳定性；以纳米差示扫描荧光（nanoDSF）测定T_m；以谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）偶联法测定动力学参数；以氨释放定量法测定蛋白质底物脱酰胺活性；构建43个单点突变体和31个组合突变体进行热稳定性表型分析；基于CpPG晶体结构（PDB ID: 2ZK9）计算相对溶剂可及性（relative solvent accessibility，RSA）。

**祖先PG的文库构建与设计**：研究人员以CpPG成熟酶区为查询序列进行BLASTP搜索，获得39条同源序列，经高度冗余序列去除后最终保留13条现存同源序列。基于该文库构建最大似然系统发育树，重建了8个祖先PG序列，命名为AncPG1至AncPG8。初步热稳定性实验显示，野生型CpPG在65°C处理10 min后完全失活，而所有祖先变体均保留残余活性，其中3个变体残余活性超过100%。

**AncPGs的生化分析**：纯化酶经50–75°C处理10 min后测定残余活性，所有AncPG变体在65°C下均保留明显活性，AncPG1、AncPG2和AncPG3在70°C下仍可检测到活性。nanoDSF测定显示，野生型CpPG的T_m为62.6°C，AncPG变体的T_m提升4.4°C至13.6°C，其中AncPG1最高（76.2°C）。在相同活性单位条件下，AncPG1、AncPG2和AncPG3对多种食品蛋白质底物释放的氨量与野生型CpPG相当。在70°C反应60 min时，AncPG1从酪蛋白酸钠、鱼明胶和大豆分离蛋白中释放的氨量分别为野生型CpPG的4.8倍、6.0倍和3.5倍。此外，T_m与催化效率（k_cat/K_m）呈负相关（Pearson r=-0.77），提示稳定性和催化活性之间存在权衡。

**提高热稳定性的关键突变鉴定**：研究人员将AncPG与野生型CpPG进行成对序列比对，共鉴定出43个氨基酸替换位点，逐一制备单点突变体并测定热稳定性。其中N148G、N154D、L156Y、L168S和D179S这5个替换可单独提高热稳定性；组合实验表明，随着替换数量增加，残余活性逐步升高，五重突变体在70°C处理10 min后残余活性最高。结构定位显示，这5个稳定化替换均位于蛋白质表面附近的环区，距离活性位点半胱氨酸至少13.7 ?，RSA分析也证实稳定化替换平均溶剂暴露程度（46%±18%）显著高于去稳定化替换（19%±21%）。

讨论部分指出，ASR能够在单步实验中获得高稳定PG变体，避免逐步叠加突变的大量工作。5个稳定化替换位于表面环区且远离活性位点，提示表面环区对稳定化替换耐受性较好，而核心区域修饰易破坏蛋白折叠。两个现存同源蛋白WP_292014484.1和WP_167029802.1的T_m分别为67.9°C和70.0°C，均高于野生型CpPG但低于AncPG1，说明该进化支中既存在热稳定性相关序列特征，祖先重建又进一步累积了稳定化替换。多个AncPG变体表现出表观热激活现象，研究人员认为这可能与加热使酶构象群体向催化活性构象偏移有关。该研究的不足包括未表征全部现存同源蛋白、未进行时间依赖性失活测定、未阐明热激活的分子机制、未开展结构动态学分析等，后续可将ASR与定向进化或结构指导设计结合以在保持稳定性的同时进一步提高催化效率。

研究结论为：总体而言，本研究确立了ASR作为一种从小型实验文库中生成高稳定PG变体的有效方法。上述发现为进一步开发适用于升温食品蛋白改性工艺的稳健PG变体奠定了基础。