甲藻共栖菌Mameliella alba通过C–P裂解酶途径降解膦酸酯并在磷酸盐限制下促进宿主生长

《Applied and Environmental Microbiology》：Phosphonate degradation through the C–P lyase pathway by a dinoflagellate-associated Mameliella alba enhances host growth under phosphate limitation

　　

膦酸酯因其化学性质稳定的碳–磷（C–P）键而区别于其他有机磷化合物，约占海洋溶解有机磷库的25%。包括甲藻在内的大多数真核浮游植物不能直接利用胞外膦酸酯，但其共栖细菌可促进对该磷源的间接利用。该研究分离并鉴定了一株能够降解膦酸酯的甲藻共栖细菌DH-1。DH-1被鉴定为Mameliella alba，其基因组含有完整的C–P裂解酶（C–P lyase）基因簇。生长实验表明，DH-1在以2-氨基乙基膦酸（2-aminoethylphosphonate，2-AEP）为唯一磷源的条件下可维持生长，说明其能利用这种生物源膦酸酯。反转录定量PCR（RT-qPCR）分析显示，在磷酸盐限制条件下，C–P裂解酶亚基phnJ和phnH以及膦酸酯转运基因phnC和phnD的转录水平显著上调。此外，phnJ和phnH的表达也受2-AEP诱导，表明DH-1中C–P裂解酶途径受Pho调控子（Pho regulon）和底物诱导的协同调控。当同时向磷限制培养物中添加DH-1和2-AEP时，甲藻东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）的生长显著增强，而仅添加2-AEP或DH-1时藻细胞均不能生长。该研究首次报道了一株特异性甲藻共栖细菌可通过降解膦酸酯释放磷酸盐来促进藻类生长。这些互作对于生活在磷限制环境中的甲藻的生态成功至关重要，为有害藻华的形成与动态提供了新见解。

重要性：膦酸酯是海洋溶解有机磷的重要组成部分。当浮游植物可直接生物利用的磷酸盐在海洋环境中稀缺时，膦酸酯可作为潜在磷源。虽然真核浮游植物通常缺乏利用膦酸酯的能力，但某些藻类共栖细菌具备降解这些化合物的能力，然而此前尚无特定菌株被深入研究。研究人员报道了一株通过特定代谢途径利用膦酸酯的细菌菌株的发现。该细菌分离自中国最普遍赤潮物种之一的东海原甲藻，能够通过提供膦酸酯降解释放的磷酸盐促进东海原甲藻生长。这些发现凸显了细菌在促进甲藻利用膦酸酯方面的关键作用。该机制可能促进有害藻华的发展，强调了海洋生态系统中藻–菌互作的生态重要性。

海洋真光层中溶解无机磷（dissolved inorganic phosphate，DIP）浓度通常极低，是限制海洋初级生产力和固氮能力的关键因子；即使在部分富营养化沿海环境，磷也可能成为限制性营养盐，并在有害藻华（harmful algal blooms，HABs）期间被广泛视为限制因子。溶解有机磷（dissolved organic phosphorus，DOP）主要包括磷酸酯和膦酸酯，其中膦酸酯约占高分子量DOP的25%。由于存在稳定的碳–磷（C–P）键，膦酸酯较难被降解。多数真核浮游植物（包括甲藻）不能直接利用胞外膦酸酯，但共栖细菌可介导其间接利用。此前相关认识多基于群落水平分析，缺乏对具体菌株及其功能角色的系统研究。为此，研究人员从中国近海重要赤潮藻东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）中分离并系统鉴定了一株具有膦酸酯降解能力的共栖菌Mameliella alba DH-1，揭示其通过C–P裂解酶（C–P lyase）途径将2-氨基乙基膦酸（2-aminoethylphosphonate，2-AEP）降解为磷酸盐，从而在磷限制条件下促进宿主生长。该工作首次对甲藻共栖菌的膦酸酯代谢进行系统表征，为理解甲藻适应磷限制及有害藻华维持机制提供了分子和生态学证据。

研究方法包括：从东海原甲藻（菌株CCMAXU-364，来源为厦门大学海洋藻类收藏中心）的2-AEP唯一磷源培养物中分离共栖菌；经16S rRNA基因测序、BLAST比对和邻接法系统发育分析鉴定菌株；对菌株DH-1进行Illumina全基因组测序与RAST注释，并计算平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）和DNA–DNA杂交（DDH）值；通过不同磷源培养实验测定细菌生长、DIP浓度和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）活性；采用RT-qPCR分析phnC、phnD、phnH和phnJ的转录水平；最后开展藻菌共培养实验评估DH-1对东海原甲藻生长的促进作用。

不同磷条件下东海原甲藻的生长响应：通过比较+P（36 μM NaH₂PO₄）、?P（不加磷）和2-AEP（36 μM 2-AEP）三种处理下的藻细胞密度、DIP浓度和AP活性，发现2-AEP处理下藻细胞密度高于?P但低于+P，且DIP在培养第4天出现短暂升高，AP活性介于+P与?P之间，表明2-AEP可作为替代磷源被降解并释放磷酸盐供藻利用。

共栖细菌的分离与鉴定：研究人员从东海原甲藻培养物中共获得32株细菌，其中31株成功扩增16S rRNA基因，分属6个属，包括Mameliella alba、Leisingera caerulea、Roseicyclus amphidinii、Alteromonas abrolhosensis、Flagellimonas marinaquae和Cytobacillus kochii。多数菌株属于Pseudomonadota门，其中24株属于Alphaproteobacteria，5株属于Gammaproteobacteria；其余分属Bacteroidota和Bacillota。DH-1与Mameliella alba的16S rRNA基因相似性达99.93%。

菌株DH-1及其他模式菌株中C–P裂解酶基因簇的基因组结构：DH-1基因组大小为5.456 Mb，GC含量为65%；与M. alba JL351的ANI为98.22%，数字DDH值为84.50%，符合物种界定标准，因此鉴定为M. alba。基因组注释显示DH-1含有完整的C–P裂解酶途径基因簇，但未发现其他膦酸酯降解途径相关phn基因。与大肠杆菌中典型的phnC–phnP排列不同，DH-1及多种海洋细菌的phn基因簇缺少phnO和phnP，存在多拷贝phnE，且基因排列顺序改变，提示膦酸酯利用途径在海洋细菌中具有基因组可塑性。

菌株DH-1以2-AEP作为磷源的利用：在2-AEP唯一磷源条件下，DH-1细胞密度从24 h起持续上升，介于+P与?P之间；DIP浓度保持较低水平，说明释放的磷酸盐被细菌迅速吸收；AP活性在前期较高后快速下降，表明2-AEP降解逐渐缓解了磷限制。此外，DH-1还能利用乙基膦酸和草甘膦作为唯一磷源生长，但生长速率低于无机磷处理。

不同磷条件下四个phn基因的转录水平：RT-qPCR结果显示，phnC和phnD在?P条件下被强烈诱导，在+P后期因磷酸盐耗尽也出现上调，符合Pho调控子的调控特征。phnH和phnJ在2-AEP条件下2 h即显著高于?P条件，且24 h持续高表达，但在72 h后明显下降，表明这两个基因除受磷限制调控外还受2-AEP底物诱导。因此，DH-1中C–P裂解酶途径的表达受Pho调控子和底物诱导的协同调控。

菌株DH-1通过利用2-AEP促进东海原甲藻生长：在共培养实验中，仅添加2-AEP或仅添加DH-1都不能显著促进磷限制下藻细胞的生长；只有同时添加DH-1和2-AEP时，藻细胞密度从第6天起显著高于所有其他处理。这表明东海原甲藻自身不能直接利用2-AEP，而DH-1通过降解2-AEP释放磷酸盐，使宿主获得额外的磷源并促进其生长。

讨论部分总结：从东海原甲藻分离的多数菌株属于与甲藻反复共现的类群，如M. alba和L. caerulea属于玫瑰杆菌分支，提示它们可能与甲藻存在重要生态关联。基因组比较显示，不同菌株的phn基因分布和结构存在差异，反映了C–P裂解酶途径在海洋细菌中的多样性。DH-1的膦酸酯转运基因主要受Pho调控子调控，而C–P裂解酶亚基基因同时受底物诱导，这种双重调控可提高对2-AEP的响应效率。当藻类快速吸收磷酸盐时，可缓解细菌C–P裂解酶途径所受的磷酸盐抑制，从而维持互惠关系。细菌降解膦酸酯后向胞外释放多余磷酸盐的机制可能与其对碳或氮的需求超过对磷的需求有关，但具体的磷酸盐外排机制仍需进一步研究。该机制使东海原甲藻在藻华期间能够利用两类主要DOP组分，从而可能影响有害藻华动态。

结论：研究人员从形成有害藻华的甲藻东海原甲藻中分离到一株能通过C–P裂解酶途径降解2-AEP的细菌Mameliella alba DH-1。当2-AEP作为唯一磷源时，该细菌可通过提供来源于2-AEP利用的磷酸盐促进其藻类宿主生长。由于甲藻不能独立利用膦酸酯，其共栖细菌可能是甲藻从海洋环境中这一重要DOP组分获取磷的关键媒介。该机制可能增强甲藻在磷酸盐耗竭环境中的适应能力，并可能影响有害藻华事件的动态。鉴于该研究主要基于实验室研究，仍需进一步开展特别是野外研究，以更好地理解有害藻华期间与磷循环相关的甲藻–细菌互作。