《Veterinary Sciences》：Exploratory Evaluation of the P22 ELISA for Antibody Detection in Fecal Samples from Tuberculosis-Infected Goat Herds
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背景：由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)成员引起的山羊结核(caprine tuberculosis, cTB)是动物和公共卫生的重要关切。基于抗体的诊断试验已成为补充反刍动物生前官方诊断技
背景：由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)成员引起的山羊结核(caprine tuberculosis, cTB)是动物和公共卫生的重要关切。基于抗体的诊断试验已成为补充反刍动物生前官方诊断技术的有前景工具，这些官方技术主要使用血清，尽管也可使用替代、更易采集的样本，如乳、口腔液或粪便。本探索性研究的目标是评估自建P22酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)在来自cTB感染群山羊粪便样本中的反应性，以血清P22 ELISA和官方诊断试验作为比较。方法：分别从高流行群(n=149)和低流行群(n=220)中在采样期间排便的51只和42只成年雌性山羊采集血清和粪便样本。这些动物接受了官方诊断技术：单皮内结核菌素试验(single intradermal tuberculin test, SIT)和比较皮内结核菌素试验(comparative intradermal tuberculin test, CIT)以及干扰素-γ释放试验(interferon-gamma release assay, IGRA)。由于没有可用的无结核群，研究人员以血清P22 ELISA作为参考分类，通过受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)分析建立初步粪便临界值。结果：高流行群粪便样本阳性动物百分比为68.6%，而低流行群未观察到阳性结果。与粪便样本相比，血清样本在两个群中均显示更高阳性数(p < 0.05)。官方诊断技术与P22 ELISA（使用血清或粪便）之间的一致性总体为轻微。当使用基于所有官方试验的联合分类作为参考时，粪便P22 ELISA检测出58.0%的试验阳性山羊，低流行群中无。结论：在本现场研究条件下（无无结核对照或无死后感染确认），粪便P22 ELISA与血清相比显示有限反应性，尤其在低流行群，表明其对结核感染山羊抗体检测的实用性有限。
论文主体解读
研究背景与问题：山羊结核(caprine tuberculosis, cTB)是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)成员，主要为*M. caprae*和*M. bovis*引起的慢性人兽共患病，可造成经济损失，并威胁家畜和人类健康。西班牙山羊群体规模在欧洲联盟中位居前列，因此cTB监测具有重要意义。生前诊断传统上依赖单皮内结核菌素试验(single intradermal tuberculin test, SIT)、比较皮内结核菌素试验(comparative intradermal tuberculin test, CIT)和干扰素-γ释放试验(interferon-gamma release assay, IGRA)，这些方法均基于细胞免疫，但敏感性和特异性并不完美。因此，检测抗MTBC抗体的方法被开发作为补充。抗体检测最初主要用于血清，近期研究探索了乳、口腔液、尿液等非侵入或易采集样本；然而，乳仅限泌乳雌性，口腔液和尿液在反刍动物中检测结核(tuberculosis, TB)感染动物的性能有限。P22 ELISA检测针对P22的抗体，P22是从牛纯化蛋白衍生物(bovine purified protein derivative, bPPD)中经亲和层析免疫纯化的多蛋白复合物，主要成分为MPB70和MPB83。该试验已在山羊血清、乳和口腔液中进行评估。粪样可无需保定或应激采集，适用于任何年龄和性别，但在家养反刍动物中尚未用于TB抗体诊断。粪抗体主要来自肠道固有层浆细胞产生的分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A, IgA)，免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)也可经转胞吞进入肠腔。cTB中山羊肠相关淋巴组织可能因吞咽呼吸道分泌物或肠道、肠系膜淋巴结受累而暴露于MTBC抗原，从而刺激局部抗体反应，但粪抗体浓度可能低，且易受胃肠道蛋白水解降解影响。因此，研究人员在两家cTB感染山羊群中探索粪样P22 ELISA反应性，与血清P22 ELISA和官方诊断试验比较，而非进行全面诊断验证。
关键方法：研究在西班牙中部两个Guadarrama奶山羊群开展，两群均曾以细菌培养确认TB感染(*M. bovis*; SB0121)。高流行群n=149，既往SIT反应率为74.5%、IGRA反应率为49%；低流行群n=220，既往SIT反应率为7.3%、IGRA反应率为9.1%。两群均实施鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, MAP)疫苗接种，研究纳入的成年山羊均视为接种过。纳入采样时排便的成年雌性山羊，高流行群51只、低流行群42只。采集粪样和血样，进行SIT/CIT、IGRA及自建P22 ELISA。粪样经重悬、离心取上清并稀释后检测，血清按既有方法检测。以血清P22 ELISA≥100 ELISA百分比(ELISA percentage, E%)为参考，用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)分析建立粪样初步临界值；采用Wilcoxon符号秩检验、McNemar检验、Spearman相关、kappa统计(kappa statistic, k)和联合官方分类敏感性分析评价配对反应性、阳性率、相关性与一致性。
研究结果：
官方诊断试验结果：在高流行群51只中，SIT标准解释阳性39只[76.5%(95%置信区间95% CI: 63.4–86.0)]，CIT阳性8只[15.7%(8.2–28.0)]，IGRA标准解释阳性22只[43.1%(30.5–56.7)]。低流行群42只中，SIT阳性6只[14.3%(6.7–27.8)]，CIT阳性1只[2.4%(0.0–12.3)]，IGRA阳性5只[11.9%(5.2–25.0)]。结论是两群官方试验反应率与预先分类的高、低流行状态相符。
粪便P22 ELISA临界值：以血清P22 ELISA≥100 E%为参考分类，ROC分析统计最优临界为41.4 E%，但E%低于50时样本光密度低于阴性对照均值，不可解释。Bootstrap分布中57 E%–60 E%常见，最终采用60 E%作为操作性临界值。曲线下面积(area under the curve, AUC)为0.743(95% CI: 0.63–0.85)，反映粪样试验重现血清P22 ELISA分类的能力，而非检测真正感染动物的能力；该临界值为初步且特定于本数据集。
高流行群粪样与血清P22 ELISA：配对样本中血清E%中位数297.3显著高于粪样103.4(p < 0.001)。按60 E%临界，51只中粪样阳性35只[68.6%(54.9–79.7)]；血清100 E%阳性44只[86.3%(74.3–93.2)]，血清150 E%阳性37只[72.5%(59.1–82.9)]。血清100 E%阳性数显著高于粪样60 E%(p < 0.05)；粪样60 E%与血清150 E%阳性数无显著差异(p = 0.824)。结论为粪样反应性低于血清严重解释，但与血清标准解释相近。
低流行群粪样与血清P22 ELISA：血清E%中位数95.0显著高于粪样32.8(p < 0.001)。粪样60 E%无阳性；血清100 E%阳性19只[45.2%(31.2–60.0)]，血清150 E%阳性5只[11.9%(5.2–25.0)]。血清100 E%阳性数显著高于粪样(p < 0.001)，但血清150 E%与粪样差异不显著(p = 0.063)。结论为低流行群粪样P22 ELISA未检出阳性。
相关性与一致性：高、低流行群血清与粪样E%均无相关，rs分别为?0.043(95% CI: ?0.315–0.235)和0.035(?0.272–0.335)。官方诊断反应者(n=36；CIT标准解释和/或IGRA严重解释)血清E%中位数255.5显著高于粪样70.7(p < 0.001)；高流行群官方反应者(n=30)为血清278.4对粪样90.1(p < 0.001)，低流行群(n=6)为血清159.6对粪样33.8(p < 0.05)。官方反应者血清与粪样E%无相关(rs=0.004; 95% CI: ?0.325–0.332)。粪样E%与bPPD接种部位皮肤褶皱厚度增加呈弱正相关但未达显著(rs=0.326; 95% CI: ?0.003–0.591; p=0.052)，与CIT定量结果和IGRA光密度(optical density, OD)相关性可忽略。官方试验与P22 ELISA一致性总体轻微：SIT与粪样P22 k=0.195，与血清P22 k=0.008；CIT与粪样P22 k=0.027，与血清P22 k=0.136；IGRA与粪样P22无一致(k=?0.029)，与血清P22轻微一致(k=0.071)。结论为P22 ELISA与细胞免疫官方试验一致性低，血清或粪样均如此。
敏感性分析：以所有官方试验联合分类为参考，阳性50只(高流行群42只、低流行群8只)。其中粪样P22 ELISA阳性29只[58.0%(44.2–70.6)]；血清100 E%阳性42只[84.0%(71.5–91.7)]，血清150 E%阳性35只[70.0%(56.2–80.9)]。联合分类阴性43只中，粪样阴性37只[86.0%(72.7–93.4)]，血清100 E%阴性22只[51.2%(36.8–65.4)]，血清150 E%阴性36只[83.7%(70.0–91.9)]。总体一致性粪样为中等(k=0.430; 95% CI: 0.258–0.602)，血清100 E%为尚可至中等(k=0.359; 0.175–0.543)，血清150 E%为中等(k=0.530; 0.361–0.699)。但该合并估计主要受群间差异驱动：高流行群联合分类与粪样P22一致性可忽略(k=0.018; 95% CI: ?0.241–0.277)；低流行群8只试验阳性山羊中粪样P22均未检出。以联合分类为参考且独立于血清结果的粪样ROC分析AUC为0.803(95% CI: 0.700–0.890)，统计最优仍为41.4 E%。临界不确定性分析中，高流行群粪样阳性在50 E%、60 E%、70 E%下分别为44只[86.3%(74.3–93.2)]、35只[68.6%(54.9–79.7)]、31只[60.8%(47.1–73.0)]；低流行群仅2只[4.8%(1.3–15.8)]超过50 E%，无超过60 E%或70 E%。这些结果反映不完美试验间的一致性，而非诊断敏感性或特异性。
讨论与结论：讨论部分总结，本研究将此前用于山羊血清和乳检测MTBC抗体的自建ELISA首次适应粪样。总体上粪样反应性有限，血清在两群均提供更高反应性。高流行群粪样P22 ELISA阳性数略高于既往口腔液报道。低流行群粪样无阳性，提示在本研究条件下粪样对低感染数量群的抗体检测实用性有限；但每类仅一个群，需更多群验证。替代解释可能是两群感染阶段或强度不同，但因未确定个体感染状态和感染时间，原文未能评估。粪样反应低于血清的可能原因包括：血清以IgG为主，而成年反刍动物黏膜表面以IgA为主，试验使用抗IgG(H+L)偶联物优化，其他同种型尤其IgA可能仅通过轻链部分检出；粪IgG浓度预计远低于血清；粪抗体在肠道转运中受宿主和微生物酶蛋白水解降解；基质效应、干扰物质、样本稀释和提取效率。这些因素被视为可能解释而非已证实机制。血清和乳样本诊断性能较好，可能更适合山羊大规模检测。血清与粪样E%无相关，与既往绵羊线虫感染中血浆和粪抗体正相关的报道不同。官方诊断工具与P22 ELISA无论血清或粪样一致性总体轻微，可能因分别基于细胞免疫和体液免疫；细胞介导反应通常在感染早期占优，体液反应随疾病进展增加，因此两类试验可识别部分不同的感染动物。粪样与IGRA无一致、与皮内试验轻微一致，可能反映免疫反应谱差异、疾病阶段差异和粪抗体检测局限。无死后或培养确认时，不一致结果不能归类为假阳性、假阴性或阶段依赖反应，现有数据不支持粪样P22 ELISA可靠识别cTB感染山羊。敏感性分析支持上述发现：合并中等一致性主要由群间差异解释，低流行群试验阳性山羊粪样均未检出，独立于血清结果的ROC分析得到相同统计最优，说明粪样临界并非仅由血清参考造成，但仍应视为初步。该结果与既往P22 ELISA使用血清和乳时与皮内试验轻微一致的大规模研究一致，因此血清P22 ELISA有潜力作为cTB诊断补充工具用于根除计划场景。总体上，粪样用于独立的抗体TB诊断仍有限，距家畜常规应用较远。粪抗体产生与黏膜免疫相关，需局部抗原刺激才能达到高抗体水平，这可能是粪样与血清差异的一种解释。虽然研究在山羊进行，但在实施牛结核根除计划的国家，牛中P22 ELISA性能可能相似甚至更低，因为长期诊断压力会降低动物达到疾病晚期和高抗体滴度的可能性；需在牛和其他非家养反刍动物中进一步研究。局限性包括：无无结核群对照，无法稳健估计特异性和独立于血清的临界值；无个体死后病变、细菌培养或分子确认；群分类基于既往SIT和IGRA，敏感性和特异性不完美；血清P22 ELISA本身也是辅助抗体试验而非确定性参考标准；仅纳入采样时排便山羊，可能存在选择偏倚；均为单一品种成年雌性半舍饲山羊，结果不能直接外推至雄性、幼龄或其他管理系统；两群均接种MAP疫苗，可能干扰TB诊断试验，虽<6月龄接种且研究羊为成年，影响预计有限，但不能排除对官方试验和血清P22反应性的贡献，对粪抗体影响未知。结果应视为探索性。
研究结论翻译：总之，在本研究现场条件下，粪样P22 ELISA对cTB的体液检测价值有限，尤其在低流行群。粪样中抗体水平和反应者数量显著低于血清样本，表明血清仍是该试验抗体检测更合适的样本。粪样在重度感染群中可能具有有限的探索价值，但这一可能性及其在其他流行病学设置中的实用性需要进一步研究。在推荐任何诊断应用前，需要进一步验证，包括无结核对照和具有死后确认感染状态的动物。
