哺乳期起始BALB/c小鼠模型中非水解与水解乳清蛋白原料致敏反应的比较

《Food Bioscience》：Comparative Sensitizing Responses to Non-Hydrolyzed and Hydrolyzed Whey Protein Ingredients in a Suckling-Initiated BALB/c Mouse Model

　　摘要水解乳清蛋白原料被用于旨在减少致原暴露的配方中，但仅水解程度并不能确定残余致原潜力。本研究使用哺乳起始BALB/c模型比较了非水解乳清蛋白(NWP)、部分水解乳清蛋白(PHWP)和深度水解乳清蛋白(EHWP)的生物学反应。通过连续方案比较选择致敏时间表，并在独立队列中确认。雌性小鼠在出生后第7、21、28和35天用分配的原料进行致敏，并在第42天接受共同的NWP口服挑战。NWP、PHWP和EHWP组的平均过敏症状评分分别为3.00、2.50和1.88。血清IgE(1.45、1.11和0.91 μg/mL)和组胺(38.07、25.87和18.83 ng/mL)遵循相同的顺序，并得到NWP结合抗体信号、血清和肠系膜淋巴结来源的细胞因子测量以及十二指肠免疫标记物模式的佐证。在单独使用存档的NWP致敏血清池进行的RBL-2H3试验中，NWP、PHWP和EHWP刺激后的β-己糖胺酶释放率分别为62.84%、46.13%和35.28%。总体而言，在共同的完整NWP挑战下，致敏相关反应在NWP中最强，PHWP中等，EHWP最低；然而两种水解物仍保留了血清依赖性脱颗粒活性。引言牛奶蛋白过敏(CMA)是对牛奶蛋白的免疫介导的不良反应，最常见于婴幼儿和幼儿期。其表现可能涉及胃肠道、皮肤、呼吸系统或几个器官系统。临床诊断和饮食管理由临床指南涉及，而牛奶衍生原料的术前评估需要受控的生物学测试。牛奶含有酪蛋白和乳清蛋白，其中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是主要致原。β-乳球蛋白在人类乳中不存在，含有公认的IgE结合表位，而α-乳白蛋白尽管与人类对应物有部分序列同源性，但仍可保留IgE结合能力。酶促水解可以改变分子大小和表位可及性，但仅水解程度并不能确定残余致原潜力。水解程度是肽键断裂的总测度；它不直接描述残余完整蛋白的丰度、释放肽的分布和序列，或免疫学可识别结构的保留。因此，具有相似名义水解值的水解物可能因原料、酶特异性、加工条件和肽组成的差异而在残余抗原识别上有所不同。肽组学研究还鉴定了具有特定生物活性的动物来源肽序列。因此，理化表征和生物学测试为原料评估提供了互补信息。当母乳喂养不可用时，水解配方在几种涉及CMA的临床环境中使用。然而，水解物不是免疫学上可互换的。因此，监管指南要求产品或水解物特定的证据，而不是仅基于水解蛋白使用而假设适宜性。定义乳清原料的生物学比较是走向这种产品级评估的上游步骤。小鼠模型对于比较评估牛奶蛋白样品是有用的，尽管它们的反应取决于菌株、发育阶段、暴露途径、佐剂、剂量和挑战方案。PND7处于断奶前哺乳期的范围内，此时肠道屏障和肠相关免疫系统仍在发育。新生小鼠中的口服耐受效率低下，并在出生后第三周后变得更加有效，而哺乳期间的母体免疫状态和抗原暴露可以影响这一窗口。因此，PND7起始与断奶或成年期的首次暴露不同。具有不同水解程度的乳清制剂如何与这一发育中的黏膜免疫环境相互作用仍未得到充分表征。残余致原性不太可能由单一终点捕获。多参数小鼠研究和FcεRI基于效应细胞试验已被用于评估乳清水解物，并能提供关于致敏、介质释放和组织相关反应的互补信息。挑战后症状提供整合的临床读出，IgE和IgG1表征体液反应，组胺和MMCP-1反映肥大细胞相关介质释放，RBL-2H3脱颗粒测试血清依赖性效应细胞激活。MLN衍生的细胞因子和肠道测量补充这些系统性终点。结合这些读出使原料可以在体液、细胞和肠道反应中进行比较。因此，本研究在小鼠模型中选择了候选致敏时间表，在独立队列中确认了时间表，并用于在共同的完整NWP口服挑战下比较NWP、PHWP和EHWP。临床、血清学、细胞和十二指肠读出与单独的RBL-2H3脱颗粒试验一起考虑。我们假设，在相同的蛋白等价致敏时间表和共同的NWP挑战下，反应在NWP组最强，PHWP组中等，EHWP组最低。章节摘要试验原料和试剂非水解乳清蛋白(NWP)、部分水解乳清蛋白(PHWP)和深度水解乳清蛋白(EHWP)由黑龙江飞鹤乳业提供。之前的水解程度和表观分子量数据可用于动物实验中使用的相同原料批次。这些测量不是作者作为本研究的一部分进行的；与报告值相关的记录分析程序候选致敏方案的选择在原料比较实验之前，四个方案成分按顺序比较：首次致敏天、抗原剂量、第一和第二次致敏之间的间隔、累积加强方案。每个阶段选择的设置带入下一次比较，因此最终时间表衍生自一致的候选方案评估序列。选择基于总IgE、组胺、IL-4、IFN-γ的组合模式……讨论本研究在哺乳期间开始的模型中比较了三种定义的乳清蛋白原料。选择的时间表在独立队列中产生了NWP相关表型，并跨临床、血清学、效应细胞、MLN衍生和十二指肠测量区分了NWP、PHWP和EHWP。NWP致敏通常产生最强的反应，PHWP中等反应，EHWP在NWP挑战后的最低反应。RBL-2H3试验产生了相同的定性顺序。结论哺乳开始的BALB/c方案产生了在独立队列中复制的NWP相关表型。在标准化致敏时间表后，以完整NWP进行共同的口服挑战，反应通常在使用NWP致敏的小鼠中最强，在使用PHWP致敏的小鼠中中等，在使用EHWP致敏的小鼠中最低。RBL-2H3试验显示了相同的顺序，并证明了两种水解物的血清依赖性脱颗粒活性。CRediT作者贡献声明Xuemei Zhu：监督，项目管理，资金获取。zihao Guo：撰写-初稿，可视化，方法学，概念化。Wenpu Yao：验证，软件，调查，形式分析。Ruida Ma：资源，数据管理。Guangqing Mu：撰写-审阅和编辑，项目管理未引用参考文献Huang et al., 2018.伦理声明本研究按照ARRIVE(动物研究：体内实验报告)指南进行。本研究经大连理工大学实验动物伦理委员会批准。(批准号DLPU2024SP014)数据可用性图表背后的动物水平数据和处理的相对表达数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。利益冲突声明作者声明没有竞争性经济利益。生成式AI和AI辅助技术在稿件准备过程中的声明在准备本作品期间，作者使用OpenAI ChatGPT支持英语语言润色、一致性检查和稿件格式。使用该工具后，作者根据需要审阅和编辑内容，并对出版内容承担全部责任。资金本工作由中国国家重点研发计划(2022YFF1100400)支持。资助方未参与研究设计；数据收集、分析或解释；稿件准备；或提交文章的决策。竞争利益声明作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或可能影响本文报告工作的个人关系。致谢作者感谢黑龙江飞鹤乳业提供本研究使用的乳清蛋白原料。Zihao Guo|Wenpu Yao|Ruida Ma|Guangqing Mu|Xuemei Zhu