基于PTR-ToF-MS的Lactiplantibacillus plantarum WCFS1在MRS中生长挥发性组在线动力学及与葡萄酒相关菌株的比较

《Food Bioscience》：Online volatilome dynamics of Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 during growth in MRS, and comparative insights with other wine-associated strains

　　

研究人员对Lactiplantibacillus plantarum在微生物培养基中生长的挥发性组（volatilome）进行了实时监测；在L. plantarum菌株中，WCFS1表现出独特的晚期挥发性有机化合物（VOCs）特征；该研究支持WCFS1作为乳杆菌（lactobacilli）和乳酸菌（LAB）挥发性组学模型菌株；丙酮酸、氨基酸和脂质来源的VOCs塑造了这些菌株的发酵；气相色谱-质谱联用（GC-MS）支持了质子转移反应飞行时间质谱（PTR-ToF-MS）对菌株特异性VOCs的注释和解释。

该论文作者包括Antonia Corvino、Emanuela Betta、Iuliia Khomenko、Vittorio Capozzi、Franco Biasioli、Mariagiovanna Fragasso。研究背景方面，乳酸菌（LAB）是一类多样性微生物，在碳水化合物代谢中产生乳酸，常见于植物、胃肠道和发酵食品中。LAB在生物技术中具有重要性，可产生具有工业、营养和功能意义的代谢物。曾被归入Lactobacillus属、现被称为乳杆菌并重新分类的物种，是食品生物技术中最相关类群之一。经分类学重新分类后，Lactiplantibacillus plantarum因其显著生态适应性和技术多能性，成为乳杆菌及LAB中研究最广泛的物种之一。L. plantarum可定殖于哺乳动物胃肠道、人唾液以及酸面团、橄榄、发酵蔬菜、香肠、奶酪和葡萄酒等多种发酵食品基质。其生态灵活性被归因于稳健发酵代谢、高酸化能力和合成抗菌代谢物的能力。将L. plantarum纳入发酵过程与风味、质构、货架期和营养品质改善相关。该物种还可生物合成胞外多糖、γ-氨基丁酸（GABA）、核黄素和挥发性有机化合物（VOCs）等生物活性化合物。L. plantarum WCFS1是LAB研究中表征最充分的模式菌株之一，具有完整测序基因组，并对其生理、遗传和代谢特征进行了广泛表征；其最初从人唾液分离，被广泛用作参考菌株以研究适应机制、益生功能和代谢多能性。尽管已有大量基因组和功能知识，但关于该菌株在细菌生长和发酵期间挥发性组的信息相对较少。由于挥发性代谢物可反映微生物生理和代谢适应，表征WCFS1挥发性组动态可加深对该菌株作为代谢行为模型及其潜在技术意义的理解。微生物VOCs研究近年来成为有前景领域，因为这些代谢物可提供微生物生理、生态适应和代谢活性信息。微生物可合成醇、醛、酮、烃、芳香化合物以及含硫和含氮分子等多种VOCs，其生物合成与碳水化合物发酵、氨基酸分解、脂肪酸代谢、硫代谢和萜烯生物合成等途径相关。在发酵食品体系中，VOCs尤其重要，因其显著贡献风味形成，并可作为监测发酵过程中微生物活动的代谢生物标志物。近期研究多采用基于气相色谱-质谱联用（GC-MS）的方法研究LAB的VOCs产生，以表征菌株特异性挥发谱及其对发酵香气发展的贡献。然而，这些研究主要聚焦VOC谱的终点表征或不同发酵条件间比较，对微生物生长期间挥发性代谢物时间演化的信息有限。在此背景下，直接进样质谱技术，尤其是质子转移反应飞行时间质谱（PTR-ToF-MS），可通过快速、高通量和在线监测VOC变化，且样品制备最少，从而克服传统色谱方法的部分局限。该能力使PTR-ToF-MS特别适合研究生长和发酵过程中的动态微生物响应。近期，PTR-ToF-MS也被用于监测包括L. plantarum在内的LAB菌株VOC产生，从而比较不同发酵条件下菌株依赖性挥发谱。然而，这些研究依赖发酵过程中的离散采样点，而贯穿微生物生长全过程的高时间分辨率在线VOC演化监测仍 largely未探索。此外，解释PTR-ToF-MS指纹通常需要GC-MS等互补分析技术支持化合物注释并改善代谢物鉴定。因此，本研究主要目的是利用PTR-ToF-MS表征L. plantarum WCFS1在MRS培养基中生长期间的挥发性组动态。此外，为提供关于菌株依赖性挥发物产生的更广泛生态视角，研究纳入五株来自葡萄酒环境的L. plantarum分离株作为比较菌株。这些菌株被选中，是因为其来源于挥发代谢尤其相关的发酵环境，使研究人员能够探索生态来源是否与挥发性组谱差异相关。次要目的是评估来源于不同生态位的菌株在相同条件下培养时是否表现出不同挥发性组特征。

研究人员开展的研究中，共纳入六株Lactiplantibacillus plantarum，记为A、B、C、D、E和F。五株商业可得菌株A、B、C、D和F此前已在酿酒中表征其促技术特性，来源于意大利University of Foggia工业微生物实验室菌株保藏；这些商业发酵剂为单菌株培养物，用于促进葡萄酒苹果酸乳酸发酵，使苹果酸降至0.5 g/L以下。菌株E对应参考菌株L. plantarum WCFS1，最初从人唾液分离，为本研究主要模式菌株。所有菌株先在De Man, Rogosa and Sharpe（MRS）肉汤中30 °C预培养24 h，随后以约10⁶ CFU/mL接种至20 mL玻璃瓶中的3 mL MRS肉汤，每个菌株六个独立生物学重复，30 °C、pH 6.2培养32 h。VOC测量从培养4 h开始，每4 h测定一次，共8个时间点。细菌生长通过OD₆₀₀每小时监测32 h，三个独立生物学重复，并用改良Gompertz模型拟合。PTR-ToF-MS用于在线VOC分析；GC-MS仅用于参考菌株WCFS1和未接种MRS培养基，采集0–32 h九个时间点，采用顶空固相微萃取（HS-SPME）。统计分析使用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）等。

研究结果中，3.1 发酵期间全局挥发性组演化：PTR-ToF-MS用于在线监测L. plantarum菌株在MRS中最佳培养条件下生长期间挥发性组演化。数据处理后保留113个赋予元素式的离子质量，其中99个获得化合物水平暂定注释。PCA包括接种样品和未接种MRS对照，显示良好实验重复性；前两个主成分解释总变异的87.66%，其中PC1为71.34%，PC2为16.32%。沿PC1出现明显时间依赖演化，并在整体模式内显示菌株依赖差异。B和D菌株挥发谱高度相似，A和F轨迹相近；C在前四个周期接近B和D，后期部分分歧；E即WCFS1轨迹最独特，尤其在晚期生长阶段分离。PLS-DA以发酵周期为分类变量，确认PCA观察到的时间组织；周期1与后续周期明显分离，周期2和3为中间阶段，周期4至8对应后期发酵且重叠更大，表明晚期挥发组更稳定但仍演化。结果表明，L. plantarum生长是挥发性组变异的重要驱动因素，而菌株身份提供额外分化，WCFS1尤为明显。

3.2 发酵期间VOC谱的时间演化：VOC时间演化在数据集中呈异质性。根据时间轨迹形状，离子被视觉分组为四种描述性动力学曲线：Profile A瞬时积累，含11个离子；Profile B渐进积累，含30个离子；Profile C耗竭，含20个离子；Profile D晚期恢复，含6个离子；平坦或不规则轨迹未归入任何曲线。时间曲线在六株L. plantarum中一致，但信号强度不同，尤其参考菌株E。Profile A代表离子m/z 49.010，暂定鉴定为methanethiol，质子化式为CH₄SH⁺，在发酵中央阶段明显增加，通常周期5最高，随后向周期7和8下降；A、E和F积累最高，未接种培养基早期和中期较低，仅在后期升高。Profile B代表离子m/z 61.028，暂定鉴定为acetic acid，质子化式C₂H₄O₂H⁺，在所有接种样品中持续增加，E在晚期为最高释放者之一。Profile C代表离子m/z 107.051，暂定鉴定为benzaldehyde，质子化式C₇H₆OH⁺，初始丰度高，随后在所有接种样品中明显下降，且接种样品下降快于未接种培养基，表明细菌生长强烈影响该信号。其他Profile C VOC主要与早期发酵相关，包括octanoic acid、2-butanone、1-butanol、2-methylbutanal/3-methylbutanal和3-methyl-1-butanol。Profile D代表离子m/z 83.085，暂定报告为未知，从周期1到周期2或3迅速下降，随后在多数菌株中呈菌株依赖行为；E在周期5至6出现二次增加，而多数其他菌株较低。周期相关离子方面，周期1主要关联Profile C类VOC；周期2有少量判别VOC如2,5-hexanedione在B和D中增至周期3后下降；周期3关联Profile B类VOC如2-heptenal和isoamyl acetate，同时E中mevalonic acid和2,3-butanedione/diacetyl较高；周期4关联10-undecenal，在E、F和A中呈Profile A趋势；周期5包含methanethiol和furan fragment等，在A中尤其明显，E中methylthioacetate和2-undecanone表现独特，F中1-octen-3-ol具特征曲线；周期6和7主要由Profile B或晚期积累离子表征，E通常达到最高值；周期8维持晚期谱，E中acetoin/isobutyric acid/butanoic acid、2-butenal和ethyl acetoacetate达到最高或接近最高。pyrazine相关信号主要关联周期3或8，在接种样品中趋势相对平坦，且也存在于培养基对照中，因此解释需谨慎。

3.3 菌株依赖挥发性组，重点L. plantarum WCFS1：PCA显示E即L. plantarum WCFS1与五株葡萄酒相关菌株相比具有最独特的挥发性组轨迹，这种分离在晚期发酵周期尤为明显。十二个质量峰对描述E特征特别有信息：m/z 63.009、71.048、87.046、89.059、91.024、107.097、131.071、143.144、151.142、169.159、171.176和189.181，分别暂定关联carbon dioxide相关信号、2-butenal、2,3-butanedione/diacetyl、acetoin/isobutyric acid/butanoic acid、methylthioacetate、未知物、ethyl acetoacetate、2-nonanone、未知物、10-undecenal、2-undecanone和1,11-undecanediol。其中m/z 63.009、151.142、169.159和171.176在E中周期5左右达到最高值，而其他若干离子持续增加至最终发酵周期。尤其m/z 71.048、87.046、89.059、91.024、131.071和143.144在WCFS1中显示明显晚期积累，将该菌株与葡萄酒相关分离株区分开。该模式与PCA和PLS-DA中的多变量分离一致，表明最明显的菌株特异差异出现在晚期生长阶段。葡萄酒相关菌株中，A和F挥发组轨迹密切相关，PCA中可见，并由多个共享动力学曲线确认；B和D也表现可比行为，尤其2,5-hexanedione在周期3前增加后下降；C呈中间谱，早期类似B和D，后期分歧。A和F对acetaldehyde趋势相似，F对1-octen-3-ol表现独特，A对hydrogen sulfide表现特定趋势。总体而言，PTR-ToF-MS结果揭示所有L. plantarum菌株共有的主导性时间依赖挥发组演化，并伴随菌株特异差异；参考菌株WCFS1尤其在晚期发酵周期表现最独特挥发组，而葡萄酒相关菌株显示部分重叠谱，其中A/F和B/D形成最明显相似对。

讨论部分总结：该研究提供L. plantarum在MRS中生长期间挥发性组演化的在线描述，并特别强调参考菌株WCFS1。结果表明，VOC产生受三个相互关联因素塑造：发酵时间、底物组成和菌株身份。时间组分是变异的主导驱动因素，而菌株依赖组分在WCFS1晚期生长阶段尤其明显。该行为与L. plantarum高代谢多能性一致，该物种能定殖多样生态位并根据底物可用性和环境条件重定向碳流。在此背景下，微生物VOCs可被视为生理状态、底物转化和菌株特异代谢潜力的动态生物标志物。实验结果表明，观察到的挥发性组反映通常与中心碳代谢、氨基酸分解、脂质转化以及植物基质中萜类生物转化相关的代谢物，尽管这些代谢来源未在本研究中直接研究。挥发性组并非静态菌株指纹，而是与细菌生长阶段相关的动态代谢输出，支持挥发性组学作为为细菌现象研究提供时间维度的“组学”策略的相关性。该发现与LAB发酵生理一致：早期细胞适应培养基并消耗易利用底物，而在指数期和稳定期逐步将代谢重定向至次级途径，包括氨基酸转化、氧化还原平衡途径和有机酸产生。MRS作为受控微生物培养基，含葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、Lab-Lemco粉、盐和生长因子，可提供可发酵碳水化合物、氨基酸、肽、核酸衍生物、矿物质和维生素，均可作为挥发性代谢物的直接或间接前体。因此，本研究检测的挥发性组不应解释为葡萄酒、乳制品、蔬菜或谷物等食品基质香气谱的直接等同物，而是受控生理挥发性组，用于在标准化生长条件下比较菌株行为。pyrazine相关信号进一步说明培养基对照的重要性；其通常与热处理和Maillard反应相关，在接种样品中趋势相对平坦且存在于未接种培养基，提示更可能连接培养基制备或灭菌，而非活跃细菌代谢，但也可能来自发酵中间体如acetoin的缩合反应，因此应谨慎解释。乙酸是L. plantarum发酵活动的关键标志物，本研究离子m/z 61.028暂定鉴定为acetic acid，并在发酵期间增加且由GC-MS确认。在LAB中，丙酮酸是连接初级碳水化合物代谢与香气活性化合物的中心代谢节点，可转化为乳酸，也可转向α-乙酰乳酸、acetoin、diacetyl、acetaldehyde、乙醇、甲酸、乙酸和CO₂。diacetyl和acetoin与发酵食品中奶油样感官特征广泛相关，但过量diacetyl可能导致不良风味失衡。m/z 87.046暂定鉴定为2,3-butanedione/diacetyl和m/z 89.059暂定鉴定为acetoin/isobutyric acid/butanoic acid，与丙酮酸衍生代谢一致。m/z 89.059的解释需谨慎，因为PTR-ToF-MS不能完全区分异构体，同名义离子可能包含acetoin、isobutyric acid和butanoic acid贡献，这证实GC-MS作为互补技术解决歧义的重要性。Profile C趋势化合物与氨基酸来源挥发物的消耗或转化一致，benzaldehyde在发酵期间下降，可来自芳香族氨基酸尤其苯丙氨酸和酪氨酸分解。支链醛和醇也贡献早期挥发性组，2-methylbutanal/3-methylbutanal和3-methyl-1-butanol呈下降趋势，通常与支链氨基酸分解相关。含硫VOC是挥发性组重要组分，methanethiol在周期5左右增加后下降，是微生物硫代谢中心中间体，可进一步转化为dimethyl sulfide、dimethyl disulfide、dimethyl trisulfide和thioesters。m/z 91.024暂定鉴定为methylthioacetate，尤其在E中检测到，与硫相关途径一致。m/z 34.995暂定鉴定为hydrogen sulfide在A周期5左右尤其明显，从酿酒角度值得注意，因为H₂S通常因低气味阈值和硫样特征被认为是葡萄酒负面香气化合物。Lp WCFS1的一个显著特征是若干暂定连接脂质转化的化合物积累，包括methyl ketones和长链羰基；m/z 115.112、143.144和171.176暂定鉴定为2-heptanone、2-nonanone和2-undecanone，在WCFS1中多个信号最高。甲基酮可来自脂肪酸代谢中β-氧化和β-酮酸脱羧，尽管热降解和Maillard相关途径也可能在复杂基质中贡献。长链醛、醇和二醇检测也指向脂质相关或羰基还原途径。最相关菌株依赖结果是Lp WCFS1与五株葡萄酒相关菌株的清晰分化。PCA显示E尤其晚期发酵轨迹独特，选定VOC动力学确认WCFS1以高于其他菌株的水平积累若干离子，包括m/z 71.048、87.046、89.059、91.024、131.071、143.144、169.159和171.176。该模式表明Lp WCFS1不仅在VOC释放量上不同，也在挥发物积累时间上不同。晚期diacetyl/acetoin相关离子增加提示WCFS1中丙酮酸耗散途径可能更强激活；类似地，methylthioacetate样和methyl ketone样信号积累提示硫氨基酸分解和脂质来源途径可能贡献WCFS1特异性挥发性组。从生态视角，该行为可能与Lp WCFS1不同来源有关：与A、B、C、D和F这些葡萄酒相关且因酿酒/促技术性状筛选的菌株不同，E最初从人唾液分离。然而，该解释应谨慎，因为本研究证明的是标准化MRS条件下的菌株依赖挥发性组行为，需在葡萄酒样和人唾液样基质中进一步实验，才能将这些VOC模式与生态适应直接联系。葡萄酒相关菌株中，A和F在acetaldehyde上升趋势值得注意，acetaldehyde是关键葡萄酒相关代谢物，可与花青素反应形成pyranoanthocyanins并可能改善颜色稳定性，但超过感官阈值可带来不愉快刺激性香气；L. plantarum中acetaldehyde产生并非组成型，且呈菌株特异性。A中H₂S瞬时积累也值得关注，提示该菌株在测试条件下硫氨基酸分解或硫还原途径可能尤其活跃。PTR-ToF-MS价值在于在线监测微生物挥发性组动态，使跨八个发酵周期的快速、重复和非侵入性VOC演化分析成为可能，提供传统离线方法难以获得的时间信息。总体而言，在线挥发性组学可捕获L. plantarum生长阶段和菌株依赖的代谢特征；在标准化MRS条件下，该物种显示共享时间挥发性组，特征是早期培养基相关化合物耗竭、中期硫和有机酸相关信号积累、晚期丙酮酸、氨基酸和脂质来源VOC形成。在此共同框架内，Lp WCFS1显示最独特晚期挥发性组，特征是diacetyl/acetoin相关信号、methyl ketones、硫相关化合物以及选定酯样或长链羰基化合物更多积累。同时，与葡萄酒相关菌株在受控MRS条件下比较，凸显风味相关应用中菌株选择的重要性，尽管这些观察需在真实发酵基质中验证。结果也确认VOC谱不应在物种水平概括：即使在相同生长条件下，L. plantarum菌株在挥发性产生的时间、强度和化学性质上也可明显不同。

研究结论部分翻译：本研究利用PTR-ToF-MS对L. plantarum WCFS1在MRS培养基中生长期间挥发性组动力学进行了在线表征，并在标准化发酵条件下与五株葡萄酒相关L. plantarum菌株直接比较。发酵阶段主要驱动挥发性物质产生，从发酵早期到晚期出现明显时间模式。在这一共同时间模式内，Lp WCFS1显示最独特的挥发性组，尤其表现为丙酮酸衍生化合物、硫相关代谢物、甲基酮和长链羰基化合物的晚期积累。比较分析表明，在受控MRS条件下，葡萄酒筛选菌株的挥发性组谱部分趋同，而总体挥发性物质产生仍具菌株依赖性。方法学上，该研究证明PTR-ToF-MS作为快速在线监测微生物挥发性组动力学的有效性，同时强调GC-MS对代谢物注释和解释的补充作用。未来需在食品相关基质中开展研究，以确定这些实验条件下观察到的菌株特异性特征是否保持。更广泛地，Lactiplantibacillus plantarum的挥发性组学表征是研究不同菌株代谢功能及其对发酵食品质量、香气和开发潜在贡献的有前景方法。