基于深度共熔溶剂的绿色提取技术制备花椒生物活性多糖：产量提升、抗氧化活性增强及功能性水凝胶的构建

《Food Chemistry: X》：Green extraction of bioactive polysaccharides from Zanthoxylum bungeanum using deep eutectic solvents: enhanced yield, antioxidant activity, and functional hydrogel formation

　　

花椒（*Zanthoxylum bungeanum*）果皮和叶片富含具有抗氧化、抗疲劳和免疫调节等生物活性的多糖，然而传统热水提取法存在提取时间长、能耗高等缺陷。本研究以氯化胆碱-草酸（ChCl-OA）深度共熔溶剂（Deep Eutectic Solvent，DES）为提取介质，结合超声辅助技术，从花椒果皮和叶片中绿色高效提取生物活性多糖。研究人员通过单因素实验和响应面法（Response Surface Methodology，RSM）优化了提取工艺参数，使果皮多糖（ZBP-D）和叶片多糖（ZBLP-D）的提取率分别达到25.88%±0.54%和29.79%±0.05%，较超声辅助水提法分别提高4.13倍和2.46倍。单糖组成分析显示，ZBP-D和ZBLP-D均含有甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）和阿拉伯糖（Ara）8种单糖，其中Glc和Gal含量最高；傅里叶变换红外光谱（FT-IR）证实提取物具有典型的多糖特征吸收峰，含有吡喃糖环结构及α-和β-构型糖单元。抗氧化活性测定表明，DES提取的多糖在DPPH和羟基自由基清除能力上显著优于水提多糖（ZBP-H和ZBLP-H），ZBP-D和ZBLP-D对羟基自由基的半抑制浓度（IC₅₀）分别低至0.231 mg/mL和0.513 mg/mL；但在ABTS⁺自由基清除方面，水提样品表现更优，呈现出自由基选择性的抗氧化谱。此外，研究人员将ZBP-D和ZBLP-D制备成功能性水凝胶，扫描电子显微镜（SEM）显示其具有致密均匀的三维多孔结构，ZBLP-D水凝胶平均孔径最大达97.6 μm；水凝胶的溶胀率约1200%，负载率分别为68.44%±0.74%和69.86%±0.81%，在最大安全负载浓度下溶血率均低于5%，表现出良好的血液相容性。该研究建立了基于DES的绿色高效提取平台，实现花椒副产物的高值化利用，为生物活性多糖的绿色提取和功能材料开发提供了理论基础与数据支撑。

**一、研究背景与选题意义**

花椒（*Zanthoxylum bungeanum*，ZB）又名川椒，是东亚地区兼具食用和药用价值的重要经济植物。其果皮和叶片占总生物量的20%–30%，是极具开发潜力的药食两用资源。现代药理学研究表明，这些部位富含多糖、挥发油和黄酮类生物活性成分，具有抗氧化、抗疲劳和免疫调节等功效。植物多糖是聚合度大于10的聚糖，具有广泛的生物活性。已有研究证实花椒叶片多糖（ZBLPs）可通过调节糖原代谢和增强抗氧化防御系统缓解体力疲劳，花椒果皮多糖（ZBPs）具有抗肿瘤、麻醉、镇痛、抗菌和抗氧化等药理特性。然而，关于ZBPs和ZBLPs高效提取技术及构效关系的研究仍然有限。传统热水提取虽操作简便、成本低廉，但存在提取时间长、能耗高等缺点；酶辅助提取虽条件温和，但成本高、难以工业化放大，且后续纯化复杂。因此，亟需开发绿色、高效的新型提取技术。深度共熔溶剂（DES）作为新一代绿色溶剂，由氢键受体（HBA）和氢键供体（HBD）通过复杂氢键网络形成均相液体，具有低挥发性、可生物降解、低毒性和物化性质高度可调等优势，已被成功用于多种植物活性成分的提取。然而，利用DES提取花椒果皮和叶片多糖的研究鲜有报道，DES提取花椒多糖的构效关系也尚不清楚。基于此，研究人员开展了本研究，旨在建立绿色高效的DES提取方法，系统评价提取性能、比较传统方法并评估所得多糖的生物活性；同时作为探索性延伸，将提取多糖制备成水凝胶，初步评价其理化性质和血液相容性。

**二、研究内容概述**

研究人员以甘肃省陇南市武都区3株健康‘武都大红袍’花椒的成熟果实和无病害叶片为原料，采用加热搅拌法合成了以氯化胆碱或甜菜碱为HBA、分别与草酸、DL-苹果酸、甘油、尿素、乙二醇和1,4-丁二醇等HBD组合的12种DES体系（含水30%，w/w）。通过超声辅助提取（60℃、60 min、液料比30:1 mL/g、超声功率500 W）筛选出氯化胆碱-草酸（ChCl-OA，摩尔比2:1）为最优DES。随后通过单因素实验考察提取温度（ET）、提取时间（ED）和液料比（SSR）对多糖得率的影响，并采用Box-Behnken设计（BBD）的响应面法（RSM）优化工艺条件。采用PMP柱前衍生化高效液相色谱（HPLC）分析单糖组成，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征结构特征，体外法评价DPPH、ABTS⁺和羟基自由基清除能力。最后，将DES提取多糖与壳聚糖、柠檬酸复合，通过冷冻-解冻循环制备水凝胶，利用扫描电子显微镜（SEM）观察微观结构，测定溶胀率、保水率、负载率、溶血率和抗氧化活性。

**三、关键技术方法**

本研究采用的技术方法主要包括：（1）DES合成与筛选：采用加热搅拌法（90℃，3–4 h）合成12种DES，以多糖回收率为指标筛选最优体系；（2）超声辅助DES提取与响应面优化：以筛选出的ChCl-OA（2:1）为溶剂，通过单因素实验确定ET、ED、SSR的适宜范围，再以三因素三水平BBD设计建立二次多项式回归模型，确定最佳提取条件；（3）多糖结构表征：PMP柱前衍生化结合HPLC分析单糖组成，FT-IR光谱鉴定官能团和糖苷键构型；（4）体外抗氧化活性评价：采用商业试剂盒测定DPPH、ABTS⁺和羟基自由基清除能力并计算IC₅₀值；（5）水凝胶制备与性能评价：以壳聚糖-柠檬酸为基质，通过物理交联法制备负载多糖的水凝胶，使用SEM观察形貌、Nano Measurer统计孔径，并测定溶胀率、保水率、负载率、溶血率和抗氧化活性。

**四、研究结果与分析**

*4.1 DES体系筛选与提取条件优化*

12种DES对ZBP和ZBLP的提取效率存在显著差异，其中DES1（氯化胆碱-草酸）对果皮和叶片多糖均表现出最高的提取效率，这可能归因于DES1与目标多糖之间更强的静电相互作用。摩尔比优化实验表明，氯化胆碱与草酸摩尔比为2:1时，果皮和叶片多糖的提取率均达到最大值。单因素实验确定最佳ET为80℃、ED为60 min、SSR为70:1 mL/g。响应面分析建立的ZBP-D和ZBLP-D回归模型均高度显著（P＜0.0001），失拟项不显著，拟合精度高（R2分别为0.9941和0.9907）。ZBP-D最优条件为ET 82℃、ED 61 min、SSR 69 mL/g，实际产量25.88%±0.54%，为水提法（6.27%±0.24%）的4.13倍；ZBLP-D最优条件为ET 90℃、ED 59 min、SSR 68 mL/g，实际产量29.79%±0.05%，为水提法（12.13%±0.83%）的2.46倍。叶片多糖产量高于果皮，可能因果皮细胞壁木质化程度高、结构更刚硬，而叶片组织细胞壁较薄且木质素含量低。

*4.2 多糖化学结构表征*

单糖组成分析显示，ZBP-D、ZBP-H、ZBLP-D和ZBLP-H四种多糖均含有Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl和Ara共8种单糖，但摩尔比存在差异，其中Glc和Gal为最主要单糖，推测含有阿拉伯半乳聚糖和葡聚糖组分。GlcA/GalA比值在DES提取样品中高于水提样品，表明DES提取可能选择性富集富含糖醛酸的酸性多糖组分。FT-IR光谱显示四种多糖具有相似吸收特征：3600–3200 cm^?1处宽吸收峰归属OH伸缩振动，3000–2800 cm^?1处为CH伸缩振动，1740 cm^?1处吸收峰来自酯化羧基CO伸缩，1620 cm^?1处为非酯化羧基CO伸缩，1200–950 cm^?1范围内为C-O-C和C-O-H的伸缩振动，证实吡喃糖构型；850 cm^?1处吸收峰表明存在α-构型糖单元。

*4.3 抗氧化活性评价*

四种多糖对DPPH、ABTS⁺和羟基自由基的清除活性均呈剂量依赖性。ZBP-D和ZBLP-D对DPPH和羟基自由基的清除能力显著强于ZBP-H和ZBLP-H，羟基自由基IC₅₀值分别低至0.231 mg/mL和0.513 mg/mL，2.0 mg/mL浓度下清除率分别达95.46%±0.61%和91.07%±0.04%。然而ABTS⁺清除实验中，水提样品活性更高。这种自由基选择性差异与提取方法导致的化学微环境不同有关：DES的酸性环境有利于富集糖醛酸含量高的酸性多糖组分，游离羧基在酸性条件下可促进OH键释放氢原子，增强氢原子转移（HAT）途径介导的DPPH和羟基自由基清除能力；而超声辅助水提可能更好地保留酚羟基、还原端等结构特征，有利于通过单电子转移（SET）机制中和ABTS⁺自由基。

*4.4 水凝胶性能评价*

SEM观察显示，空白水凝胶（BLK）呈现稀疏多孔结构，完整三维网络较少；而ZBP-D和ZBLP-D水凝胶呈现更致密均匀的多孔结构，孔隙壁清晰，表明多糖引入通过氢键或静电相互作用与壳聚糖基质结合，增强网络稳定性。孔径分析表明，ZBLP-D水凝胶平均孔径最大（97.6 μm）。ZBP-D和ZBLP-D水凝胶的溶胀率均为约1200%，显著高于BLK水凝胶（773%±28%），负载率分别为68.44%±0.74%和69.86%±0.81%。溶血实验显示，ZBP-D水凝胶最大安全负载浓度为2.0 mg/mL，ZBLP-D水凝胶为4.0 mg/mL，溶血率均低于5%，满足生物医用材料基本安全要求。水凝胶中多糖的抗氧化活性较游离多糖有所降低，可能是因为网络限制、扩散受限以及交联反应修饰了活性基团。

**五、讨论与结论总结**

本研究表明，ChCl-OA（2:1）DES体系通过强氢键竞争破坏植物细胞壁多糖网络，草酸的酸性促进糖苷键水解，低粘度提高传质效率，耦合超声空化效应，协同实现多糖高效释放。DES提取选择性富集糖醛酸含量高的组分，从而赋予多糖更强的HAT途径自由基清除能力。DES参数（粘度、pH、可回收性）未全面表征，脱蛋白效率未定量验证，结构表征仅限单糖组成和FT-IR；抗氧化活性为粗多糖整体贡献（可能含残留DES、共提取酚类等）的叠加，非纯化多糖的单一效果。研究结论为：基于ChCl-OA（2:1）的DES结合超声辅助可显著提高花椒果皮和叶片多糖提取效率，产量较水提法提高4.13倍和2.46倍；DES提取多糖表现出选择性增强的抗氧化活性，对羟基自由基的IC₅₀分别为0.231 mg/mL和0.513 mg/mL；ZBP-D和ZBLP-D可成功制备功能性水凝胶，具有致密多孔结构（最大孔径97.6 μm）、高溶胀率（~1200%）和良好负载率（68.44%–69.86%），最大安全负载浓度下溶血率＜5%。该研究为花椒副产物高值化利用提供了可持续的高效提取平台，为生物活性多糖功能材料开发提供了基础数据，但距离实际生物医学应用还需进行力学性能、细胞毒性、抗菌活性和体内伤口愈合等全面评价。