《Food Control》：Effect of dry sanitization on dry surface biofilm of
Cronobacter sakazakii
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干燥表面生物膜（dry surface biofilm，DSB）在低水分食品（low moisture food，LMF）加工环境中持续存在，可能成为克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）的持续污染源。本研究评估了五种干法消毒方法（70%乙醇
干燥表面生物膜（dry surface biofilm，DSB）在低水分食品（low moisture food，LMF）加工环境中持续存在，可能成为克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）的持续污染源。本研究评估了五种干法消毒方法（70%乙醇、含25%异丙醇和0.015%季铵化合物的商业产品、90±2°C热风、45±2 mg/L气态臭氧和254 nm UV-C光）与次氯酸钠（sodium hypochlorite，SH，200 mg/L，pH 6.5）对在聚丙烯（polypropylene，PP）和不锈钢（stainless steel，SS）表面形成的C. sakazakii DSB的杀灭效果。DSB采用两种水合/干燥循环方案（T1：48 h/48 h；T2：24 h/120 h）形成。干法消毒剂在两种表面和两种方案下均未产生显著效果，30 min暴露后的菌落减少量均小于1 log CFU/cm2。相比之下，SH处理在T2方案下15 min内、T1方案下30 min内实现了大于5 log CFU/cm2的减少量，表明其具有更高的杀菌效力。共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）分析显示，经SH处理后仍存在高比例的绿色染色（活）细胞，提示可能存在活但不可培养（viable but non-culturable，VBNC）状态的细胞。研究结果表明，C. sakazakii DSB对干法消毒具有高度抗性，而SH可作为有效的替代方案，但需严格控制湿度并立即干燥处理区域。CLSM结果提示VBNC细胞的存在，这对基于可培养性的常规微生物监测提出了额外挑战。
论文解读
一、研究背景与意义
克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种机会性病原体，主要威胁新生儿和免疫功能低下人群。近年来，美国已报告两起与受C. sakazakii污染的婴儿配方奶粉（powdered infant formula，PIF）相关的感染事件，2021年发生一起孤立病例，2022年暴发疫情导致4例感染和2例死亡。2022年至2024年间，全球共发生7起涉及C. sakazakii污染PIF的召回、撤回或暴发事件。该病原体在奶粉和面粉中的全球流行率约为8.4%，在巴西PIF中的检出率高达23.33%。C. sakazakii具有极强的耐干燥能力，可在PIF中存活长达90天，这一特性与其在低水分食品（LMF）加工环境中的持续存在密切相关。
干燥表面生物膜（DSB）是一种在干湿交替条件下形成的特殊生物膜类型，首次在医疗领域被报道，近年来开始在食源性病原体研究中受到关注。DSB的形成需要交替的水合和干燥阶段，细菌在湿润阶段生长繁殖，随后在干燥阶段激活对脱水的应激响应。研究表明，DSB可能对消毒处理具有抗性，部分病原体在此条件下可降低代谢并存活数月。此外，细菌在饥饿和干燥等应激条件下可进入活但不可培养（VBNC）状态，该状态下细胞无法在常规培养基上生长，但仍保持代谢活性和膜完整性。VBNC细胞通常对消毒剂更具耐受性，且常规基于可培养性的微生物分析会低估实际细菌数量，给消毒策略的制定带来挑战。
尽管DSB可能促进微生物在食品加工环境中的持续存在，但针对C. sakazakii DSB对化学和物理消毒处理抗性的研究此前尚属空白。LMF行业不推荐采用湿式清洁，因为水的引入可能促进微生物生长，因此需要采用干法消毒替代方案。基于上述背景，本研究系统评估了五种干法消毒方法与次氯酸钠（SH）对在聚丙烯（PP）和不锈钢（SS）表面形成的C. sakazakii DSB的杀灭效果，为低水分条件下该病原体的消毒控制提供数据支持。
二、主要技术方法
研究人员使用了五株此前从低水分产品中分离的C. sakazakii菌株（P4499—预煮奶粉；P4787—预煮米基谷物；P4791—姜粉；P4795—燕麦米粥；P4798—面包屑），混合制备约6 log CFU/mL的接种液。DSB在PP和AISI 304 SS试片（2×5 cm）上形成，采用两种水合/干燥循环方案：T1方案为48 h水合/48 h干燥，T2方案为24 h水合/120 h干燥，各含两个循环。消毒处理包括70%乙醇、含25%异丙醇和0.015%季铵化合物的商业产品、90±2°C热风、45±2 mg/L气态臭氧、254 nm UV-C光（约1.5 mW/cm2）以及SH（200 mg/L，pH 6.5），暴露时间为0、5、10、15和30 min。消毒后通过中和、洗脱和TSA平板计数测定存活菌数，并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合LIVE/DEAD染色评估活死细胞分布。统计分析采用单因素方差分析和Tukey事后检验。
三、研究结果
3.1 消毒剂对C. sakazakii DSB的杀灭效果**
DSB初始种群密度在7.5至8.4 log CFU/cm2之间，满足消毒剂效力测试所需的最低6.0 log CFU/试片要求。五种干法消毒方法对PP和SS表面的C. sakazakii DSB均表现出有限作用，所有方法在30 min内的减少量均未超过1 log CFU/cm2。总体上，同一干法消毒剂在不同暴露时间或不同DSB方案之间无显著差异（p>0.05），仅在T1方案下，70%乙醇处理5 min和热风处理10 min时，不同表面材料之间存在显著差异（p<0.05）。
70%乙醇的最大减少量为0.9 log CFU/cm2，出现在T1方案PP表面处理5 min时；商业产品的最大减少量为0.6 log CFU/cm2（15 min）。热风处理的最大减少量不超过0.6 log CFU/cm2，即使暴露30 min也是如此。气态臭氧和UV-C的最大减少量分别为0.6和0.7 log CFU/cm2。研究人员指出，DSB形成过程中的脱水应激可能改变应激蛋白产生、细胞膜组成并促进更致密的胞外聚合物（EPS）基质形成，这些因素可能与干法消毒方法的高抗性有关。此外，经受干燥应激的生物膜EPS具有更多非特异性结合位点，可能阻碍消毒剂扩散并降低抗菌效果。
相比之下，SH的效果显著优于干法处理，5 min暴露即实现大于1.0 log CFU/cm2的减少量。暴露时间和DSB方案均显著影响SH性能（p<0.05），T2方案下15 min内、T1方案下30 min内实现大于5.0 log CFU/cm2的减少量。结果表明，T2方案中较短的水合阶段（24 h）和/或较长的干燥期（120 h）增加了C. sakazakii对SH的敏感性。
3.2 CLSM图像分析
CLSM分析显示，阳性对照（0 min）样本中DSB呈异质性覆盖，绿色染色（活）细胞比例为37%至75%。DSB外层因暴露于更强的脱水应激而含有更高浓度的死细胞，这些外层可能作为内层活细胞的保护屏障。经30 min消毒处理后，不同消毒剂的效果存在差异：70%乙醇在T1方案下降低绿色细胞比例，但在T2方案下增加或无变化；商业产品和臭氧在两种方案和两种表面上均降低绿色细胞比例；热风在SS上增加绿色细胞比例而在PP上相反；UV-C在大多数场景下增加绿色细胞比例。
值得注意的是，SH处理后尽管平板计数已降至检测限附近或以下，但CLSM仍显示高比例的绿色染色细胞。研究人员提出两种可能解释：细菌存活被高估，或存在VBNC细胞。LIVE/DEAD染色基于膜完整性原理，而SH灭活细胞代谢（丧失可培养性）先于显著膜损伤发生，因此死细胞可能呈现绿色荧光。此外，氯暴露后使细胞呈现红色染色所需的碘化丙啶浓度可能高于常规水平。此前已有研究报道C. sakazakii在干燥应激条件下可进入VBNC状态，包括在DSB中。因此，CLSM结果提示SH处理后可能存在VBNC细胞，这对基于可培养性的常规监测构成额外挑战。
四、讨论与结论
本研究表明，C. sakazakii DSB对干法消毒程序表现出强抗性，30 min暴露内的减少量均小于1 log CFU/cm2。从风险管理角度看，通过干法消毒控制C. sakazakii仍是LMF行业特别是PIF加工厂面临的挑战。相比之下，SH实现了大于5 log CFU/cm2的减少量，凸显其作为该环境中控制C. sakazakii DSB的有效选择，前提是严格控湿并在消毒后立即干燥生产线。然而，研究结论仅限于所评估的实验条件，在推广至工业环境前需进行验证。此外，CLSM图像提示氯消毒后存在VBNC状态细胞，这是在制定环境监测和控制措施时必须考虑的额外挑战。未来研究应探讨不同干法消毒方法的联合效应及其与机械作用的交互影响，并开展表征脱水应激诱导的代谢和转录组响应及其对干法消毒剂耐受性贡献的研究，以增进对这些生物膜在工业环境中控制的理解。
