《Food Chemistry》：Improved thermal stability of 1,4-α-glucan branching enzyme via the semi-rational design of the flexible loops and disulfide bonds for starch modification
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•通过刚性化柔性环区域提高了酶的热稳定性。•设计的二硫键进一步增强了结构刚性和热稳定性。•最佳突变体使t?/?增加了56分钟，T??增加了4.15°C。•分子动力学模拟证实了最佳突变体具有更高的稳定性。•耐热突变体改善了马铃薯淀粉的食品应用特性。引言1,4-α-葡聚糖分支酶（
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通过刚性化柔性环区域提高了酶的热稳定性。
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设计的二硫键进一步增强了结构刚性和热稳定性。
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最佳突变体使t?/?增加了56分钟，T??增加了4.15°C。
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分子动力学模拟证实了最佳突变体具有更高的稳定性。
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耐热突变体改善了马铃薯淀粉的食品应用特性。
引言
1,4-α-葡聚糖分支酶（GBEs，EC 2.4.1.18）是一类糖基转移酶，通过水解α-1,4-糖苷键并将释放的低聚糖链转移到C-6羟基上形成α-1,6-糖苷键来修饰淀粉（Ban, Wu, et al., 2020; Hayashi et al., 2017）。尽管GBEs在功能上根据IUBMB酶命名法被归类为糖基转移酶，但由于其转糖苷活性，它们在结构上属于糖苷水解酶（GH）超家族。具体来说，微生物GBEs主要被归入CAZy数据库中的GH13或GH57家族（Lombard et al., 2014; Suzuki and Suzuki, 2016）。来源于微生物的GBEs因其多功能性和异源表达的便利性而被广泛研究（Ban, Dhoble, et al., 2020）。淀粉的支化程度，受GBEs影响，决定了淀粉的可消化性、糊化行为和回生倾向——这些是控制淀粉基食品质量的关键参数——这使得GBEs成为制备新型功能食品的关键（Smith et al., 2020; Xia et al., 2021）。在高温淀粉修饰过程中，GBEs需要增强的热稳定性；然而，当前的GBEs仍面临满足工业淀粉加工严格要求的挑战。这些挑战包括在通常高于70°C的糊化温度下保持高催化活性，在长时间反应过程中保持稳定性，并消除对高能耗冷却步骤的需求（Ban, Wu, et al., 2020; Y. T. Liu et al., 2017）。
为了提高GBEs的热稳定性，近期研究调查了来自嗜热葡萄糖苷酶地衣芽孢杆菌STB02的GtGBE的静电效应。突变体Q231R/K-D227-D131H和T339D/E-K335-I291H被发现使60°C下的半失活时间（t?/?）增加了15–21%，而相应的双残基盐桥则比野生型（WT）GtGBE高出17–51%（Ban, Wu, et al., 2020），并且K137E突变体通过额外的静电键稳定了GBE环结构，实现了36.6%的改进（X. Ban et al., 2023）。尽管取得了这些进展，许多有前景的GBEs仍未被充分探索。其中，来自热泉嗜热菌（AaGBE）的GBE因其超嗜热起源而被战略性选择，为75°C的高温加工提供了有力的候选者（Ban, Dhoble, et al., 2020）。提高其半衰期对于满足经典工业修饰中数小时持续活性的要求至关重要，同时也消除了淀粉糊化后通常需要的高能耗冷却步骤。
然而，仍存在两个关键限制。首先，先前的工程努力在很大程度上依赖于可用的晶体结构，但AaGBE缺乏实验解析的结构，这给结构引导的理性设计构成了重大障碍。其次，耐热GBEs用于增强食品功能的淀粉修饰潜力尚未被系统探索。我们假设，通过AlphaFold2预测的结构模型引导，结合柔性环刚性化和二硫键引入，可以有效地提高AaGBE的热稳定性，同时不会过度损害其催化功能。因此，本研究的主要目的是开发一种适用于缺乏晶体结构的酶的半理性工程策略，并评估由所得耐热突变体修饰的淀粉的食品相关理化特性。
近年来，高精度的蛋白质结构预测工具，如AlphaFold2，使得缺乏实验结构的靶标酶的工程改造成为可能（Casadevall et al., 2023）。例如，AlphaFold预测的模型已被用于识别和工程改造新型聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）水解酶，以及分析没有晶体结构的蛋白质的功能位点（W. Liu et al., 2024）。然而，仅基于预测模型的综合实验验证仍然有限。本研究提出了一种从计算设计到实验验证的结构自由工作流程，旨在解决AaGBE的热稳定性限制。具体来说，环区域作为蛋白质动力学柔性的弱点，通常是修饰的首选靶标，因为刚性化环内的柔性位点可以有效地减少构象波动并防止高温下的不可逆展开（T. Li et al., 2022; Yu et al., 2017; Zhao et al., 2021）。此外，通过设计二硫键可以提高酶的热稳定性（Ren et al., 2025）。例如，Disulfide by Design软件被用于预测γ-环糊精糖基转移酶的潜在二硫键突变体，结果得到了半衰期增加3.17倍的突变体S172C-R183C（Hu et al., 2024）。这种方法基于有针对性的考虑：首先，对AlphaFold2预测的AaGBE模型的分析显示，非催化区域包含许多与周围残基接触有限的柔性环区域，这些是动力学柔性弱点的潜在来源。其次，序列和结构分析表明，AaGBE天然仅含有三个不形成二硫键的半胱氨酸残基。这表明该蛋白具有未利用的二硫键工程容量，并且在柔性环区域引入二硫键可以提供远程构象约束，而不会破坏现有结构特征。通过结合局部优化和全局结构锁定，这种组合策略克服了单修饰方法的局限性，为稳健的酶工程提供了协同解决方案。在本研究中，AlphaFold2生成的AaGBE模型作为半理性设计的基础。使用分子动力学（MD）模拟研究了突变体热稳定性提高的机制。工程化的AaGBE被评估了其修饰马铃薯淀粉的能力，以及增强与食品加工相关的功能特性，包括冷水溶解性、冻融稳定性和消化性特征。
章节片段
菌株、载体和培养条件
大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pHTN06/AaGBE已预先构建并储存于大肠杆菌DH5α中。AaGBE由枯草芽孢杆菌DB403表达。DH5α在LB肉汤（OXOID，英国）中培养，转速220 rpm，温度37°C，当细菌含有pHTN06及其重组质粒时，添加最终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素（BBI，中国）。DB403在LB或TB肉汤（OXOID，英国）中培养，转速220 rpm，温度37°C，添加最终浓度为10 μg/mL的氯霉素（BBI，中国）。
使用AlphaFold2对AaGBE进行结构建模
合理设计AaGBE以提高其热稳定性的有效方法是基于可靠的结构信息，针对环区域的柔性弱点。然而，AaGBE的晶体结构尚未被解析。因此，我们使用AlphaFold2（L. Wang et al., 2024）生成了AaGBE的结构模型，并基于该模型，使用了一种结合互补方法的混合计算策略，以预测跨……
结论
在本研究中，我们开发了一种半理性策略，结合基于MRMS的柔性环刚性化和二硫键工程，由AlphaFold2预测的模型引导，在没有晶体结构的情况下提高AaGBE的热稳定性。最佳五重突变体V155L-V280I-D282N-H408C-W536C在85°C下表现出81分钟的t?/?（是野生型的3.24倍，+56分钟）和87.77°C的T??（比野生型高4.15°C）（图8）。随后，MD模拟显示突变体具有较小的……
CRediT作者贡献声明
郑张：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证，方法学，数据整理。许瑞：软件，方法学，形式化分析，数据整理。赵文静：可视化，数据整理。杨婷：软件，方法学。王聪：验证，资源。苏伟：数据整理。牛燕宁：资源。常中义：项目管理。金明飞：撰写——初稿，资源。黄晶：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，资金。
资金
作者们衷心感谢华东师范大学生命科学学院仪器共享平台和翼展（上海）生物科技有限公司的支持。
利益冲突声明
作者们声明他们没有已知的相互竞争的经济利益或个人关系，这些可能被认为会影响本论文中报告的工作。
郑张|许瑞|赵文静|杨婷|王聪|苏伟|牛燕宁|常中义|金明飞|黄晶
