《Food Microbiology》：Identification and characterization of biofilm-degrading aptamers against
Escherichia coli by Inhibition-SELEX and analysis of their target proteins and interactions
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摘要大肠杆菌是食品加工环境中常见的污染物，其生物膜形成能力可显著增强其对消毒剂和抗生素的耐受性，从而对食品安全构成严重威胁。本研究采用抑制性系统进化配体指数富集法（Inhibition-SELEX）筛选并获得了三个对已形成的大肠杆菌生物膜具有强降解作用的适配体（D1、D2和D
摘要
大肠杆菌是食品加工环境中常见的污染物，其生物膜形成能力可显著增强其对消毒剂和抗生素的耐受性，从而对食品安全构成严重威胁。本研究采用抑制性系统进化配体指数富集法（Inhibition-SELEX）筛选并获得了三个对已形成的大肠杆菌生物膜具有强降解作用的适配体（D1、D2和D3）。在浓度为2 μM、作用2小时的条件下，D1、D2和D3对大肠杆菌生物膜的降解率分别为70.80%、72.40%和72.24%，而它们对非靶标细菌（铜绿假单胞菌、鳟鱼假单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、杀鱼气单胞菌和副诺卡氏菌）生物膜的降解率均低于20%。与四环素联用时，对大肠杆菌生物膜的降解率分别提高至82.66%、81.83%和84.03%。结构分析表明，D2采用扁平的三级结构，表现出极高的柔韧性和构象变异性。通过磁分离、十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱分析，鉴定出D2的靶标蛋白为赖氨酸-tRNA连接酶（Lys-tRNAL）和外膜蛋白A（OmpA）。分子对接分析揭示，D2通过四个结合位点分别与Lys-tRNAL和OmpA相互作用。在结合位点处，D2可能通过其碱基中的O原子与靶标蛋白中亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸和甲硫氨酸的N、C和S原子形成氢键或静电相互作用，从而影响靶标蛋白的结构和功能，破坏维持生物膜稳定性的相关蛋白的活性和生物合成，最终导致生物膜快速降解。本研究为食品加工环境中大肠杆菌生物膜污染的防控提供了一种新策略，对保障食品安全和减少食品生产中的微生物污染具有实际的指导意义。
引言
由有害微生物污染引起的食品安全问题日益受到关注（Zhao等，2026a）。大肠杆菌是食品加工环境中常见的污染物，由大肠杆菌污染引发的食品安全事件也频繁发生（Barlaam等，2019；Zhao等，2026b）。通常，当大肠杆菌等病原菌（包括如大肠杆菌DH5α等低毒力菌株）形成生物膜时，其对消毒剂、抗生素和恶劣环境条件的耐受性显著增强（Hu等，2022），使它们能够在食品加工仪器和设备等固体表面上持续存活。这可能导致长期的微生物污染，不仅危及食品安全和质量（Van Houdt & Michiels，2010），还可能引发各种慢性感染（Yang等，2024）。
针对生物膜产生菌的传统策略通常依赖于联合疗法或高剂量抗生素治疗。然而，这些方法可能促进交叉耐药性、多重耐药性甚至"超级细菌"的出现（Pusuluri等，2019；Zhou等，2019），并导致环境污染。超声（Erriu等，2014）、光动力疗法（Warrier等，2021）和脉冲电场（Billinge等，2014）等物理方法也被报道用于应对生物膜产生菌，但其成本往往较高。消毒剂（Buckingham-Meyer等，2007；Talebian等，2020）、氧化剂（Somers & Wong，2004）和植物提取物（Bazargani & Rohloff，2016；Dzuvor等，2022）已显示出良好的抗生物膜活性；然而，长期高浓度应用可能造成环境污染。此外，抗菌肽（Yeom等，2016；Lee等，2017）和噬菌体（Harper等，2014；Adhikari等，2015；Chen等，2017）在生物膜降解方面表现出较高潜力，但其安全性和有效性仍需进一步评估。因此，迫切需要探索和开发对抗细菌生物膜的新策略和有效方法。
适配体是单链核酸分子，通过系统进化配体指数富集（SELEX）过程在体外筛选获得。由于其具有高度的靶标识别能力，在生物传感、疾病诊断和药物递送方面具有巨大的应用潜力（Zou等，2019；Zhang等，2024）。适配体能够对靶标细菌产生的生物膜发挥抑制和清除作用（Shatila等，2020；Gao等，2025；Yan等，2026a），因此可用于生物膜的防控。
传统SELEX旨在富集具有高度靶标亲和力的适配体，但许多亲和力筛选出的适配体表现出较弱或无抑制效果。因此，我们在传统SELEX基础上开发了一种抑制性SELEX策略，专门富集对靶标具有强抑制活性的适配体（Fan等，2025；Yan等，2026b）。其核心原理是：抑制性适配体必须与靶标细胞结合，对其发挥功能性作用，并最终促使其死亡。因此，即使细胞死亡后，抑制性适配体仍应保留对靶标细胞的可测量亲和力。因此，通过首先分离死细胞，然后从死细胞中回收结合的适配体，即可获得抑制性适配体。此外，由于死细胞在总细胞群体中所占比例极小，从死细胞中分离抑制性适配体作为关键的富集步骤。对分离出的抑制性适配体进行PCR扩增，并重复结合、分离和扩增的循环（如传统SELEX中所做的那样），可逐步富集对靶标细胞具有更强抑制活性的适配体。
本研究聚焦于食品加工环境中大肠杆菌的生物膜污染问题。利用我们前期工作（Fan等，2025）建立的抑制性SELEX技术，筛选出具有强生物膜降解活性的适配体，然后通过磁分离和质谱分析分离并鉴定相应的靶标蛋白。最后，我们采用分子对接和其他生物信息学方法分析生物膜降解适配体与其靶标蛋白之间的相互作用，并探讨了生物膜降解的分子机制。这些发现可能为去除食品系统中污染微生物形成的生物膜提供一种创新且可行的策略，并为有效控制食源性污染微生物提供新的见解。
章节摘要
细菌与培养
大肠杆菌DH5α菌株购自上海生工生物工程有限公司，副诺卡氏菌152894菌株由河南省工业微生物菌株工程技术研究中心提供。铜绿假单胞菌、鳟鱼假单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌和杀鱼气单胞菌分离自患病鱼类，由病原微生物实验室提供并鉴定。
SELEX筛选与候选适配体选择
以大肠杆菌生物膜为靶标进行了三轮抑制性SELEX。各轮SELEX非对称PCR扩增产物的凝胶电泳结果如图1A所示。图片显示所有三个样本均呈现清晰明亮的条带，表明大肠杆菌生物膜降解适配体在早期阶段即已富集。如图1B所示，适配体的生物膜降解率随每一轮的进行逐步提高，且始终高于该轮次之前的水平。
结论
本研究采用抑制性SELEX获得了三个对大肠杆菌表现出强生物膜降解活性的适配体（D1、D2和D3）。D1、D2和D3（2 μM）在仅处理2小时后，对大肠杆菌的生物膜降解率分别为70.80%、72.40%和72.24%。在相同条件下，这三个适配体对非靶标细菌（创伤弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌、鳟鱼假单胞菌、杀鱼气单胞菌和副诺卡氏菌）的生物膜降解率均低于20%。
CRediT作者贡献声明
王佳恩：资源，调查。翁启彪：资源，调查。黄立行：方法论，调查，概念化。严青皮：方法论，调查，概念化。郑江：写作—审阅与编辑，写作—初稿撰写，监督，方法论，调查，经费获取，数据整理，概念化。高德吉：写作—审阅与编辑，写作—初稿撰写，方法论，调查，数据整理，概念化。陈永明：
未引用参考文献
Adhav和Saikrishnan，2023；Shahryari等，2021；Tomaszewska和Guga，2021。
资金
本工作由中国国家重点研发计划（编号：2025YFD2400301）、厦门市自然科学基金（编号：3502Z202573062）、福建省高校产学研合作项目（编号：2024N5006）、福建省星火计划项目（编号：2024S0008）和福建省自然科学基金（编号：2021J01823、编号：2023J01762）资助。
利益冲突声明
? 作者声明，不存在可能影响本文报道工作的已知经济利益冲突或私人关系。
高德吉|黄江源|严伟|陈永明|赵凌敏|黄立行|严青皮|王佳恩|翁启彪|郑江
集美大学水产学院，教育部鳗鱼产业现代技术工程研究中心，国家水产育养殖种质重点实验室，中国厦门
