《Emerging Contaminants》：Combined estrogenic effects of mycotoxin zearalenone with other phyto-, xeno-, and mycoestrogens on Tg(
vtg1:mCherry) zebrafish embryos
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玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种由镰刀菌属真菌产生的真菌雌激素。尽管人们日益认识到人类和野生动物通常暴露于复杂的内分泌干扰物混合物而非单一化合物，但天然存在的异雌激素和/或植物雌激素之间的相互作用仍知之甚少，且大多基于体外实验进行评估。在本研究中，研究人员应用Tg
玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种由镰刀菌属真菌产生的真菌雌激素。尽管人们日益认识到人类和野生动物通常暴露于复杂的内分泌干扰物混合物而非单一化合物，但天然存在的异雌激素和/或植物雌激素之间的相互作用仍知之甚少，且大多基于体外实验进行评估。在本研究中，研究人员应用Tg(vtg1:mCherry)转基因斑马鱼胚胎模型，检验了ZEN与植物雌激素（大豆苷元(daidzein, DAI)和染料木素(genistein, GEN)）、农药相关化合物（草甘膦(glyphosate, GLY)和氨甲基膦酸(aminomethylphosphonic acid, AMPA)）、塑料来源的异雌激素（双酚A(bisphenol A, BPA)和双酚S(bisphenol S, BPS)）、其自身结合代谢物（ZEN-14-O-硫酸酯(zearalenone-14-O-sulfate, Z14S)和ZEN-14-O-葡萄糖醛酸酯(zearalenone-14-O-glucuronide, Z14GA)）以及其他真菌雌激素（交链孢酚(alternariol, AOH)和交链孢酚-3-O-硫酸酯(alternariol-3-O-sulfate, A3S)）的联合雌激素效应。染料木素、草甘膦和双酚类即使在纳摩尔和/或低微摩尔水平（在该模型中单独未显示雌激素影响）也能显著增强ZEN诱导的雌激素性。然而，Z14S和A3S降低了ZEN诱导的响应，在纳摩尔浓度下作用最显著。有趣的是，Z14S还能降低17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)的作用，而A3S则增强其作用，提示后者具有复杂的调节能力。响应加和性分析发现，与染料木素(0.75 μM)、双酚A(0.25 μM和0.75 μM)和双酚S(0.75 μM)存在显著的超加和性；而与氨甲基膦酸(0.25 μM)和A3S（所有测试浓度）则观察到亚加和性。
玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）是镰刀菌属真菌产生的霉菌毒素，常见于玉米等谷物，可激活雌激素受体（ERs），是一种典型的环境内分泌干扰物。人类和野生动物通常通过饮食和环境暴露于多种雌激素化合物的复杂混合物，而不仅仅是单一化合物。然而，ZEN与天然存在的异雌激素（xenoestrogens）和植物雌激素（phytoestrogens）之间的相互作用仍很不清楚，且以往研究多基于体外实验，缺乏体内模型的验证。为此，研究人员利用Tg(vtg1:mCherry)转基因斑马鱼胚胎模型，该模型通过肝脏荧光蛋白表达可非侵入性定量雌激素活性，并同时反映肝毒性，适合评价混合物的联合效应。本研究旨在探讨ZEN与植物雌激素（大豆苷元DAI和染料木素GEN）、农药相关化合物（草甘膦GLY和氨甲基膦酸AMPA）、塑料来源异雌激素（双酚A和双酚S）、ZEN自身结合代谢物（Z14S和Z14GA）以及其他霉菌毒素（交链孢酚AOH和A3S）在纳摩尔至低微摩尔浓度下的联合雌激素效应。
研究人员将斑马鱼胚胎暴露于0.31 μM ZEN与不同浓度（0.25、0.75、2.0 μM）的上述化合物单独或联合处理120小时，通过肝脏mCherry荧光强度评估雌激素活性。结果发现：DAI、AMPA、Z14GA和AOH对ZEN诱导的荧光仅产生±20–30%左右的小幅变化；而GEN、GLY、BPA和BPS即使在其单独不表现雌激素活性的浓度下，也能显著增强ZEN的雌激素效应，例如0.75 μM GEN使ZEN效应增加约65%，2 μM GLY增加约55%，0.25 μM BPA增加约68%，0.75 μM BPS增加约88%。相反，Z14S和A3S明显减弱ZEN效应，在0.25 μM时分别降低约65%。响应加和性分析表明，GEN（0.75 μM）、BPA（0.25和0.75 μM）和BPS（0.75 μM）表现为超加和（supra-additivity），而AMPA（0.25 μM）和A3S（所有浓度）表现为亚加和（sub-additivity）。此外，与E2联合实验显示，Z14S可降低E2诱导的荧光，而A3S反而增强E2效应，提示其调节机制复杂。在体外BLYES酵母试验中，这些化合物单独无雌激素活性，与ZEN或E2联合未见显著影响，可能由于酵母对硫酸化代谢物摄取有限。本研究的意义在于：提供了ZEN与其他雌激素物质在体内模型中的联合效应数据，揭示了低浓度下增强或减弱效应的可能性，并为混合物风险评价提供了参考。
本研究主要采用以下关键技术方法：①Tg(vtg1:mCherry)转基因斑马鱼胚胎模型：由匈牙利农业与生命科学大学环境毒理学系建立，通过肝脏特异性表达mCherry荧光蛋白，暴露后120小时采集图像，用ImageJ定量积分密度；②响应加和性模型：对每个浓度和重复计算期望加和响应，比较观察响应与期望的差，用配对t检验和Holm校正评估超/亚加和性；③BLYES酵母菌株体外雌激素活性测定：基于人雌激素受体α（hERα）和发光报告基因，检测生物发光；④统计方法包括双因素方差分析和Tukey检验。样本来自该系斑马鱼实验室，每处理4个重复，每重复25枚胚胎。这些方法结合了体内和体外模型，系统评价了联合雌激素效应。
根据原文小标题，研究结果如下：
3.1 Effects of ZEN on Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos：ZEN在25–400 μg/L范围内浓度依赖性诱导荧光，100 μg/L与E2阳性对照相当；600 μg/L时荧光下降且出现肝形态改变，提示肝毒性，故联合实验选用100 μg/L（0.31 μM）。
3.2 Combined estrogenic effects of phytoestrogens (DAI and GEN) with ZEN：DAI单独无效应，联合ZEN变化轻微；GEN单独仅2 μM弱激活，但与ZEN联合时0.75 μM即显著增强，且0.75 μM GEN判定为超加和。
3.3 Combined estrogenic effects of pesticide-related compounds (GLY and AMPA) with ZEN：GLY和AMPA单独均无活性；AMPA联合ZEN无总体显著差异，但0.25 μM AMPA表现为亚加和；GLY浓度依赖地增强ZEN效应，2 μM时显著，但未达非加和性。
3.4 Combined estrogenic effects of plastic-derived xenoestrogens (BPA and BPS) with ZEN：BPA 0.25 μM显著增强ZEN效应，2 μM反而降低；BPA 0.25和0.75 μM为超加和。BPS各浓度均增强，0.75 μM最强且为超加和。
3.5 Combined estrogenic effects of ZEN conjugates (Z14S and Z14GA) with the parent mycotoxin：Z14S显著降低ZEN效应，0.25 μM作用最大，但未达非加和性；Z14GA无显著影响。
3.6 Combined estrogenic effects of AOH and A3S with ZEN：AOH仅在0.75 μM时显著降低ZEN效应；A3S各浓度均显著降低，且全部判为亚加和。
3.7 Comparison of the estrogenic effects of phytoestrogen–ZEN and xenoestrogen–ZEN combinations：对比显示GEN、GLY、BPA和BPS为强增强剂（+55–88%），Z14S和A3S为强抑制剂（约-65%），其余变化较小。
3.8 Combined estrogenic effects of Z14S, AOH, and A3S with E2 on Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos：Z14S降低E2诱导效应（0.25 μM显著），AOH无影响，A3S浓度依赖地增强E2效应（2 μM显著）。
3.9 Combined estrogenic effects of Z14S, AOH, and A3S with ZEN and E2 in the in vitro BLYES assay：BLYES中三种化合物单独无雌激素活性，联合ZEN或E2无显著影响，阳性对照4-HT显著拮抗，可能受酵母摄取能力限制。
在讨论中，作者指出Z14S和A3S对ZEN及E2的不同调节作用提示其可能通过非经典途径干扰雌激素信号，直接和间接毒效学以及毒代动力学机制均可能参与。研究结论为：人类和动物实际上暴露于雌激素化合物的复杂混合物，因此理解这些鸡尾酒效应（混合物毒性）至关重要。本研究在Tg(vtg1:mCherry)斑马鱼胚胎上证实，GEN、GLY、BPA和BPS可强烈增强ZEN的雌激素效应，而Z14S和A3S可减弱之；超加和与亚加和相互作用分别出现在特定组合中。这些发现为体内混合物毒性提供了新证据，但机制仍需进一步研究，未来应建立更广浓度范围的单剂量-反应曲线，并考虑广义浓度加和模型。
