《Brain Research》：Stage-specific exposure to an activity-permissive medium enhances neuronal activity in oligodendrocyte-enriched cortical organoids
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少突胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system, CNS）的髓鞘形成细胞，为神经元提供轴突绝缘和代谢支持。关于少突胶质细胞在人类遗传背景下的发育和成熟轨迹的知识仍然有限，且主要从死后组织中推断而来。虽然已建立多种从人类诱导多能干细胞（
少突胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system, CNS）的髓鞘形成细胞，为神经元提供轴突绝缘和代谢支持。关于少突胶质细胞在人类遗传背景下的发育和成熟轨迹的知识仍然有限，且主要从死后组织中推断而来。虽然已建立多种从人类诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）生成少突胶质细胞的方法，但二维（2D）环境无法捕捉体内存在的多样化细胞异质性、微环境以及复杂的少突胶质细胞-神经元相互作用。iPSC来源的脑类器官的出现已改变了人类大脑发育建模的方式。然而，在Madhavan等人建立的少突胶质细胞富集皮层类器官（oligodendrocyte-enriched cortical organoids, OCOs）方案中，长时间培养于传统基础培养基（如Neurobasal培养基和DMEM）虽支持神经元培养的长期生长和存活，但不支持自发性神经元活动。BrainPhys是一种化学成分明确的神经元培养基，旨在弥合传统培养条件与体内细胞外环境之间的差距，提供支持自发性神经元活动和长期生长的日益生理相关的环境。鉴于电活动在神经元和少突胶质细胞发育中的重要性，研究人员研究了在允许自发活动的环境中长期维持OCOs的效果。使用改良的BrainPhys配方，此处称为神经元活性培养基（Neuronal Activity Media, NAM），研究人员确定了最佳发育时间窗口，在此期间暴露于允许活动的环境可最大程度地增强OCOs中的神经元活性。研究证明，在OPC扩增期之前阶段特异性暴露于NAM可显著增强OCOs中的神经元活性。OCOs中增强的活性与类器官尺寸增加、突触形成增强以及细胞异质性增高相关，表现为多样化神经元群体的出现。重要的是，少突胶质细胞谱系细胞在NAM条件下得以保留。总而言之，这些研究建立了一种在异质性、生理相关细胞环境中维持少突胶质细胞谱系进展的同时具有增强神经元活性的OCO模型。
论文解读：阶段特异性NAM暴露增强少突胶质细胞富集皮层类器官的神经元活性与结构复杂性
一、研究背景与科学问题
少突胶质细胞作为中枢神经系统（central nervous system, CNS）的髓鞘形成细胞，为神经元提供轴突绝缘和代谢支持。长期以来，对少突胶质细胞的基础认知主要来源于啮齿动物模型，而其在人类遗传背景下的发育和成熟轨迹知识仍然有限，多依赖于死后组织的推断。尽管已有多种方法可从人类诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）生成少突胶质细胞，但二维（2D）培养环境无法充分再现体内存在的细胞异质性、微环境以及复杂的少突胶质细胞-神经元相互作用。
iPSC来源的脑类器官凭借iPSCs的内在自组织能力，能够捕获此前无法触及的人类大脑发育阶段，多种细胞类型（包括神经祖细胞、星形胶质细胞和多种神经元亚型）在类器官内协调共发育，重现复杂的细胞相互作用。类器官不仅呈现结构特征，还表现出自发性突触活动、组装功能性网络，并重现中孕期神经元的电生理特性。
Madhavan等人建立的少突胶质细胞富集皮层类器官（oligodendrocyte-enriched cortical organoids, OCOs）方案通过暴露于血小板衍生生长因子AA（platelet-derived growth factor AA, PDGF-AA）和胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1, IGF-1），随后在神经元扩增后给予甲状腺激素（T3），支持少突胶质前体细胞（oligodendrocyte progenitor cells, OPCs）和成熟髓鞘形成少突胶质细胞的形成。该模型省略了腹侧化或尾侧化形态发生素（包括音猬因子SHH和视黄酸），产生具有背侧端脑身份的OCOs，重现了背侧皮层祖细胞来源的少突胶质细胞的独特发育起源。
然而，该方案描述的是在传统基础培养基中的长时间培养。传统培养基（如Neurobasal培养基和DMEM）虽支持神经元培养的长期生长和存活，但不支持自发性神经元活动，限制了在背侧类器官系统中进行神经元-少突胶质细胞相互作用的功能建模。BrainPhys作为一种化学成分明确的神经元培养基，旨在弥合传统培养条件与体内细胞外环境之间的差距，提供支持自发性神经元活动和长期生长的生理相关环境，并通过促进自发活动间接增强神经元成熟。
鉴于电活动在神经元和少突胶质细胞发育中的重要性，本研究旨在探讨在允许自发活动的环境中长期维持OCOs的效果，确定NAM暴露的最佳发育时间窗口，并系统表征增强活性OCOs的细胞和分子特征及其对少突胶质细胞发育和分化的影响。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员使用四种独立iPSC系（三女一男，均具有正常核型）生成OCOs。其中两个女性细胞系（WC-24-02-DS-B和ILD11-3）已在先前研究中得到充分表征；男性细胞系DS1-iPS4-disomic由Orkin实验室生成；另一男性对照细胞系BU3-10-Cr2来自波士顿大学再生医学中心。
关键技术方法包括：钙成像技术（使用AAV编码GCaMP8s标记神经元，评估自发神经元活动）；单细胞RNA测序（scRNA-seq，10X Genomics平台，对第118天类器官进行转录组分析）；免疫组织化学（IHC）及定量分析（QuPath和Imaris软件）；突触标记物共定位分析；神经元-少突胶质细胞接触分析（3D体积重建）；类器官面积测量；CellChat细胞间通讯推断分析；与人类胎儿参考数据集（Lattke et al., 2026，涵盖中孕期PCW 10-20）的转录组相似性比较。
三、研究结果
3.1 第40天暴露于NAM最大程度增强OCOs活性
研究人员首先在维持于神经元培养基（NM）的OCOs中评估自发神经元活动基线水平，发现在第110天仅有2.67%的神经元表现出可检测的钙活动，并在另外三个iPSC系中验证了这一低活性现象。随后，研究人员在OPC扩增期之前（第40天）和之后（第70天）两个关键时间点引入NAM。结果显示，第40天和第70天开始NAM暴露均显著增加自发活动，但第40天暴露的OCOs表现出最显著的活性增强（33.14%活性神经元 vs. NM组12.2%；p=0.0029），且事件率显著增加（0.82峰/分钟 vs. 1.53峰/分钟；p=0.0347）。第70天暴露组虽活性神经元比例增加（22.36%），但事件率无显著差异。在无少突胶质细胞富集的常规皮层类器官（COs）中，第40天和第70天NAM暴露均显著增强活性，但第70天暴露组事件率显著增加，与OCOs的反应模式不同，表明两类类器官对NAM存在阶段依赖性差异。面积测量显示，第40天NAM-OCOs在第90天和第110天显著大于NM-OCOs和第70天NAM-OCOs，且持续增大，而第70天NAM-OCOs仅在110天大于NM组并停止增大。基于活性、放电频率和尺寸的协同增加，研究人员将第40天确定为NAM暴露的最佳时间窗口。
3.2 NAM-OCOs细胞异质性增加
scRNA-seq分析共保留8,933个细胞，产生17个转录组学上不同的簇，鉴定出七种主要细胞类型：兴奋性神经元（ExN）、抑制性神经元（InN）、放射状胶质细胞（RGC）、中间前体细胞（IPC）、Reelin+细胞（RELN）、星形胶质细胞（Astro）和少突胶质细胞谱系细胞（OLLC）。NAM-OCOs中InN比例增加（6.87% vs. NM组1.18%），OLLC比例也略有增加（6.26% vs. 4.17%）。免疫染色证实NAM-OCOs中囊泡GABA转运体（VGAT）阳性斑点/MAP2显著增加（8.00% vs. 5.43%；p=0.0130），转录组分析显示GABA合成和传递相关基因（GAD1、GAD2、SLC32A1）表达增加，而早期中间神经元发育标记物（DLX1、DLX5）表达降低。与人类胎儿数据集比较显示，NAM-OCO InNs与更晚孕周（PCWs）胎儿组织具有更高的转录组相似性，表明向更高级发育状态转变。兴奋性神经元方面，深层（CTIP2+）和浅层（SATB2+）神经元比例在两组间无显著差异，SOX2+祖细胞池也相当，提示NAM-OCOs尺寸增加可能并非源于扩增的祖细胞池或改变的ExN产生，而可能反映增强的神经突分支和复杂性。
3.3 NAM-OCOs结构复杂性和细胞通讯增强
对ExN亚群的差异表达分析显示，NAM暴露后上调的差异表达基因（DEGs）富集于mRNA加工、树突发育、神经元投射组织和突触传递等生物学过程，而下调DEGs主要富集于细胞呼吸、氧化磷酸化、线粒体组织和细胞质翻译。ExN与胎儿参考数据比较显示NAM-OCO ExNs与更晚胎儿PCWs具有更高相关性。突触密度定量分析显示，NAM-OCOs中PSD-95斑点密度显著增加（5.91个/100μm2 MAP2 vs. 3.77个；p=0.00252），突触前（Synaptophysin）和突触后（PSD-95）标记物共定位也显著增加（3.45个/100μm2 vs. 2.07个；p=0.0267）。CellChat分析显示NAM-OCOs中推断的细胞间相互作用数量和强度均增加，主要富集于细胞黏附、细胞外基质（ECM）和轴突导向信号通路。
3.4 NAM-OCOs中少突胶质细胞发育得以保留
第70天CC1+少突胶质细胞数量在两组间无差异（5.61% vs. 5.83%；p=0.849），表明NAM暴露不影响早期少突胶质细胞扩增。第110天和第150天，CC1+细胞总数及CC1和MBP共表达细胞比例均无显著差异。3D体积重建显示NM和NAM-OCOs中均存在高度分支的少突胶质细胞与神经元轴突接触，NF-H和CC1表面重叠定量无显著差异（13.58% vs. 16.94%；p=0.0958）。OLLC转录组分析显示NAM暴露与微管运动、细胞突起和纤毛组装相关通路的上调相关，同时下调细胞质翻译、氧化磷酸化和线粒体组织相关通路。CellChat分析显示NAM-OCO OLLCs中富集轴突导向、ECM和细胞黏附程序，包括胶原蛋白、肝配蛋白B（EPHB）和神经调节蛋白（NRG）信号，以及增强的PDGF信号。
四、讨论与结论
研究人员证明，在OPC扩增期之前阶段特异性暴露于NAM可增强OCOs中的神经元活性，建立了一个整合增强神经元活性与少突胶质细胞谱系发育的模型。NAM暴露促进GABA能中间神经元向更高级发育状态转变，这可能通过抑制性信号改善网络成熟和复杂性，从而贡献于观察到的增强活性和网络复杂性。NAM-OCOs尺寸增加而无祖细胞和层状组成变化，提示尺寸增加可能与增强的神经突生长和分支相关。增强的细胞间通讯和形态复杂性可能促进连接性，与增加的突触密度和神经元发育状态变化共同导致NAM-OCOs中活性升高。
关于代谢表型，研究人员意外发现兴奋性神经元和少突胶质细胞群体中氧化磷酸化相关转录本减少。一种可能的解释是3D类器官系统固有的代谢限制——随着OCOs尺寸增加，有限的氧气扩散可在类器官中心产生缺氧环境，有利于糖酵解代谢。因此，NAM-OCOs的代谢表型可能反映对3D类器官培养中氧气和扩散限制的适应性反应。
在少突胶质细胞方面，尽管转录组学提示NAM暴露后OLLC比例略有增加，但蛋白质水平上未检测到少突胶质细胞数量或MBP表达的差异。转录变化提示增强的OPC分化和分支，如微管动力学、突起延伸和纤毛功能相关转录本表达升高。原纤毛作为细胞外线索的关键信号枢纽，调节少突胶质细胞增殖和分化。细胞通讯分析也揭示NAM-OCO OLLCs中与分支、神经元相互作用和增殖相关的富集信号程序。
研究人员指出，捕获神经元活性和少突胶质细胞谱系细胞为研究人类细胞系统中的少突胶质细胞-神经元相互作用提供了宝贵机会。NAM-OCOs为理解增强的神经元活性如何修饰OPC-神经元相互作用以及其在疾病中的破坏提供了有力工具。
研究局限性包括：NAM中驱动变化的精确培养基成分未知；需要额外的电生理学研究（如MEA记录和单细胞膜片钳）来确认NAM对神经元成熟程度的影响；钙成像在各自培养条件的培养基中进行，无法完全区分持续性发育效应与急性培养基依赖性兴奋性；转录组学研究仅在一个细胞系和一个NAM独立样本中进行，属于初步探索性结果。
综上所述，研究人员建立了一个包含少突胶质细胞谱系细胞和自发活跃神经元的日益全面的OCO模型，证明阶段特异性NAM暴露增强OCOs的功能和结构发育，同时保留少突胶质细胞谱系完整性，为研究健康和病理背景下塑造少突胶质细胞及其与神经元相互作用的精确信号机制和细胞线索奠定了基础。
