NOTCH1与ADORA3定义的新型转分化相关预后指数用于胶质母细胞瘤预后分层

《Brain Research Bulletin》：NOTCH1 and ADORA3 define a novel transdifferentiation-related prognostic index for prognostic stratification in glioblastoma by integrating clinical factors

　　

研究人员发现，NOTCH1和ADORA3定义了一种转分化相关的胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）预后指数，即胶质母细胞瘤转分化指数（glioblastoma transdifferentiation index，GTN）。固定的GTN系数在两个外部GBM队列中实现了可靠的生存分层；在调整O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）甲基化状态及竞争性生物学程序信号后，GTN仍保持独立的预后价值。将GTN与年龄和化疗状态联合，可支持GBM患者的个体化生存预测。此外，基因沉默研究显示，敲低NOTCH1或ADORA3在体外和体内均可减少内皮样表型，进一步验证了该指数的生物学基础。

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人最常见的恶性原发性脑肿瘤，尽管采用最大安全手术切除联合放疗和替莫唑胺化疗的Stupp方案，患者预后仍极差，中位无进展生存期仅6.7个月，5年生存率低于5%。肿瘤侵袭性和治疗抵抗与旺盛的血管生成密切相关。近年研究发现，除依赖宿主内皮细胞的经典血管生成外，胶质瘤干细胞（glioma stem cell，GSC）可直接转分化为内皮细胞，形成非经典血管网络，这一转分化（transdifferentiation）过程是抗血管生成治疗抵抗和不良预后的重要原因。因此，精准识别核心转分化相关基因并将其与临床变量整合，对个体化风险分层和治疗决策具有重要临床意义。

研究人员基于文献筛选出12个GSC-ET（GSC-to-endothelial transdifferentiation）相关候选基因，在CGGA训练队列中通过Kaplan-Meier生存分析和单变量/多变量Cox回归确定NOTCH1和ADORA3为独立预后因素，并构建了GTN指数（GTN index = 0.363×NOTCH1 + 0.286×ADORA3）。该指数在TCGA和Murat两个外部队列中均能显著区分高低风险患者，且经MGMT甲基化及缺氧、干性、增殖、间质和免疫等竞争性信号调整后仍保持独立预后价值。将GTN指数与年龄和化疗状态整合构建的风险评分模型及列线图可预测0.5、1、2年生存概率，ROC、校准曲线和决策曲线分析显示其具有良好的预测效能和临床净获益。功能实验表明，敲低NOTCH1或ADORA3可减少内皮样管形成、CD31表达及低密度脂蛋白摄取，并在原位异种移植模型中降低CD31阳性染色，验证了这两个基因在转分化相关内皮样表型中的功能作用。该研究为GBM提供了基于转分化机制的新型预后工具，有助于个体化风险分层和治疗策略优化。

主要关键技术方法如下：研究数据来源于GlioVis平台中的CGGA（125例）、TCGA（117例）、Gravendeel（96例）和Murat（50例）四个公开队列，均为原发性IDH野生型GBM；Gravendeel仅用于肿瘤与正常组织差异表达分析。候选基因通过文献检索预先定义。采用Kaplan-Meier生存分析和单/多变量Cox回归筛选独立预后基因，构建GTN指数，并将固定系数直接应用于外部队列验证。随后整合年龄、化疗状态构建风险评分模型，用列线图可视化，通过时间依赖ROC、C-index、校准曲线和决策曲线分析评估性能。使用TIMER数据库分析基因与免疫浸润的相关性。功能实验采用siRNA敲低U87和U251胶质瘤干细胞样细胞中的NOTCH1或ADORA3，通过管形成、CD31免疫荧光、DiI-Ac-LDL摄取及原位异种移植模型评估内皮样表型。

研究结果如下：

3.1 肿瘤与正常组织之间GERGs差异表达：通过TIMER和Gravendeel/TCGA队列比较，发现12个转分化相关基因在泛癌中预后模式异质；其中ADORA3、NOTCH1、JAG1、WNT5A、P4HA1、HIF1A在GBM肿瘤组织中显著高于正常组织，TEK显著下调。

3.2 GTN指数模型的构建与验证：在CGGA队列中，Kaplan-Meier分析显示NOTCH1、ADORA3和WNT5A高表达与较短总生存期（overall survival，OS）相关；单变量Cox回归显示ADORA3、NOTCH1、WNT5A、HIF1A显著影响预后；多变量Cox回归确认ADORA3和NOTCH1为独立风险因素。基于二者构建GTN指数，高GTN指数患者生存显著缩短（HR=2.54）。

3.3 GTN指数可靠性验证：在TCGA和Murat外部队列中，根据中位GTN指数将患者分为高低风险组，Kaplan-Meier分析显示高风险组OS显著较差，证实GTN指数具有稳定的预后分层能力。

3.4 风险评分模型的构建与验证：单变量和多变量Cox回归显示年龄、化疗状态和GTN指数为独立预后因素，整合三者构建风险评分模型并绘制列线图；ROC分析显示模型预测AUC>0.7，决策曲线分析表明临床净获益良好。

3.5 风险评分模型可靠性评估：在TCGA和Murat中验证，模型定义的高风险组OS显著较差；时间依赖ROC显示1年和2年AUC在TCGA中分别为0.78和0.74，在Murat中分别为0.69和0.72；Harrell's C指数分别为0.717和0.706，校准图显示预测与观察生存概率吻合良好。

3.6 NOTCH1和ADORA3表达与免疫细胞浸润的关联：使用TIMER分析显示，NOTCH1表达与CD4⁺T细胞和巨噬细胞正相关，与CD8⁺T细胞和中性粒细胞负相关；ADORA3与多数免疫亚群正相关（尤其CD4⁺T细胞、B细胞和巨噬细胞），提示两者参与GBM免疫微环境调控。

3.7 敲低NOTCH1或ADORA3减少转分化相关内皮样特征：在U87和U251细胞中siRNA敲低后，Western blot验证敲低效率；管形成实验显示血管样网络形成减少，CD31荧光强度降低，DiI-Ac-LDL摄取显著下降；原位异种移植肿瘤中CD31阳性染色显著减少，表明两种基因均促进内皮样表型获得。

讨论部分指出，NOTCH1是维持GSC干性、自我更新和治疗抵抗的关键调控因子，也是GSC-ET的分子开关；ADORA3连接缺氧信号与GSC适应，参与血管生成和免疫调节。免疫分析显示二者与特定免疫细胞浸润相关，可能反映肿瘤微环境中的细胞组成差异。功能实验证实两种基因在内皮样分化中的驱动作用，为GTN指数的生物学基础提供了有力证据。研究局限性包括公共数据库的批间异质性、IDH野生型GBM仍存在的空间异质性、siRNA潜在的脱靶效应等；未来需通过多区域采样、单细胞测序和空间转录组学评估GTN指数在不同肿瘤区域的稳定性，并采用挽救实验或CRISPR编辑进一步验证基因特异性。

研究结论可翻译为：本研究表明，NOTCH1和ADORA3是与GBM预后显著相关的关键基因，基于二者构建的GTN指数在多个独立队列中均具有稳定的预后分层能力，将GTN指数与年龄和化疗状态整合可有效预测个体化生存概率；功能实验支持这两种基因在转分化相关内皮样表型中的驱动作用。该模型若经前瞻性验证，有望用于风险适应性随访和治疗策略调整的临床试验设计。