《Frontiers in Immunology》：Integrative transcriptomic and computational analysis associates Ms4a6c+ macrophages with fibrosis in radiation proctitis and computationally nominates MOTS-c as a candidate modulator
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摘要专业翻译
背景： 慢性放射性直肠炎（chronic radiation proctitis, CRP）是临床面临的重大挑战，其特征为不可逆纤维化且缺乏特异性药物干预手段。本研究旨在阐明组织修复障碍背后的细胞机制，以寻找新的治疗靶点。
方法： 研究人员采用整
摘要专业翻译
背景： 慢性放射性直肠炎（chronic radiation proctitis, CRP）是临床面临的重大挑战，其特征为不可逆纤维化且缺乏特异性药物干预手段。本研究旨在阐明组织修复障碍背后的细胞机制，以寻找新的治疗靶点。
方法： 研究人员采用整合性分析框架，将机器学习与bulk转录组测序及高分辨率单细胞转录组分析相结合，应用于小鼠CRP模型。计算机制分析包括调控子推断、细胞间通讯分析及单细胞虚拟敲除模拟。所鉴定的巨噬细胞亚群的促纤维化关联进一步通过来自肝硬化（liver cirrhosis, LC）和特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）的独立单细胞数据集进行验证。此外，研究人员开展了基于结构的虚拟筛选和分子动力学模拟，以识别潜在的药理调控分子。
结果： 研究人员鉴定出Ms4a6c为一个关键候选基因，该基因特异性表达于一个独特的混合激活型巨噬细胞亚群中，该亚群与促纤维化转录程序相关。预测这些巨噬细胞通过Thbs1-Cd47旁分泌信号与成纤维细胞相互作用从而参与纤维化，SCENIC调控子分析鉴定出Cebpb为候选上游转录调控因子。在肝硬化和特发性肺纤维化单细胞数据集中的跨疾病分析表明，Ms4a6c高表达巨噬细胞亚群始终与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和TGF-β信号活性升高相关，支持其在多个器官系统中可能具有保守的促纤维化作用。此外，单细胞虚拟敲除模拟预测Ms4a6c的计算性敲除可能逆转促纤维化转录特征。分子对接和动力学模拟进一步鉴定出线粒体衍生肽MOTS-c为预测靶向Ms4a6c的最高排名候选分子。
结论： 本研究揭示了Ms4a6c?巨噬细胞潜在的致病参与作用，并鉴定出Cebpb-Ms4a6c-Thbs1-Cd47轴为可能跨多种器官纤维化模型保守的候选促纤维化信号级联。研究人员提出MOTS-c作为减轻辐射诱导肠道纤维化的潜在药理制剂，有待实验验证。
论文解读
一、研究背景与意义
慢性放射性直肠炎（CRP）是盆腔放疗后常见的严重并发症，影响5%–20%的癌症幸存者，其中2%–5%出现严重后遗症。尽管精准放疗技术如调强放疗（IMRT）已广泛应用，CRP仍是临床治疗的难题。该病通常在放疗结束后3–6个月出现，从出血、里急后重等症状逐步进展为严重的纤维化狭窄和梗阻。目前临床上对CRP的管理仍以经验性和姑息性治疗为主，包括局部用药、高压氧或内镜下凝固治疗，严重病例需手术干预。然而，目前尚无FDA批准的药物能够有效逆转辐射诱导的肠道纤维化，这一治疗缺口源于对潜在细胞和分子机制认识不足。
巨噬细胞已被证实是肾脏、肝脏、肺和心脏等器官纤维化的关键调控细胞，但驱动辐射诱导肠道纤维化的特异性巨噬细胞亚群此前尚未被鉴定。传统的M1/M2二元分类已不足以解释组织巨噬细胞的异质性，近年来的单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究揭示了不同组织中存在独特的促纤维化巨噬细胞群，但在受照射肠道中这些群体的身份和调控动态仍 largely 未表征。本研究正是针对这一空白，通过整合转录组学和计算方法系统解析CRP中的细胞机制，寻找新的治疗靶点。
二、研究设计与关键技术方法
研究人员建立了局部盆腔照射（25 Gy）的小鼠CRP模型，使用定制3D打印装置配合4 mm铅屏蔽实现精准照射，以模拟临床放射性直肠炎的慢性纤维化阶段。研究采用了以下主要关键技术方法：（1）bulk RNA测序结合两种机器学习算法（LASSO回归和SVM-RFE）进行候选基因筛选；（2）高分辨率单细胞RNA测序（10x Genomics平台，共62,913个细胞）解析细胞异质性；（3）CellChat细胞间通讯分析预测巨噬细胞与成纤维细胞的相互作用；（4）SCENIC调控子推断鉴定上游转录调控因子；（5）scTenifoldKnk单细胞虚拟敲除模拟预测Ms4a6c功能；（6）基于AlphaFold蛋白结构预测的虚拟筛选和100 ns分子动力学（MD）模拟鉴定候选药物分子。此外，研究还利用两个独立公开单细胞数据集（肝硬化GSE136103和特发性肺纤维化GSE135893）进行跨疾病验证，并通过qRT-PCR、Western blot和多色免疫荧光（Opal多重免疫荧光技术）进行了分子和组织学验证。临床样本来自陆军军医大学第二附属医院手术切除的配对直肠组织（照射后肿瘤周围组织与未照射远端正常组织）。
三、主要研究结果
1. 局部盆腔照射小鼠模型成功复现CRP关键纤维化和炎症特征
研究人员通过定制3D打印装置对小鼠进行25 Gy局部盆腔照射，在8周内观察到照射组小鼠进行性病理改变，包括显著体重下降、疾病活动指数（DAI）升高、腹泻和便血等症状。第8周结肠镜检查显示严重黏膜损伤（血管缺失、水肿、溃疡），结肠镜评分显著升高（P < 0.001）。组织病理学证实广泛纤维化，组织学评分、纤维化面积和胶原沉积均显著增加，且纤维化空间上局限于远端直肠。
2. 双重机器学习方法鉴定Ms4a6c为辐射诱导纤维化的候选基因
Bulk RNA测序（每组n=5）显示照射组与对照组显著分离（PC1：96.5%方差），共鉴定出408个上调基因和92个下调基因。GSEA分析显示ECM组织、炎症和EMT等纤维化标志通路富集。LASSO回归筛选出6个候选基因，SVM-RFE筛选出40个特征基因，两者交集获得5个收敛候选基因：Ms4a6c、Col6a2、Zfp708、Flnc和Ncf1。qRT-PCR和Western blot验证确认Ms4a6c和Col6a2在转录和蛋白水平均显著上调。与结构蛋白Col6a2不同，Ms4a6c是免疫相关膜蛋白，提示其可能具有调控作用。
3. 单细胞分析鉴定Ms4a6c?巨噬细胞为具有双重炎症和促纤维化特征的转录独特亚群
scRNA-seq分析（62,913个细胞）通过UMAP delineated 九个细胞谱系。Ms4a6c表达严格局限于巨噬细胞，多色免疫荧光证实其与F4/80共定位（而非PDGFR-α）。巨噬细胞按Ms4a6c中位表达分为Ms4a6c?和Ms4a6c?亚群（各2,028个细胞）。Ms4a6c?巨噬细胞呈现混合激活状态，同时富集TGF-β/M2和NF-κB标志物，并伴随氧化磷酸化、EMT和血管生成特征。在亚群水平，Ms4a6c?巨噬细胞的EMT和TGF-β信号评分显著高于Ms4a6c?巨噬细胞（EMT P = 3.66 × 10?3?，TGF-β P = 1.56 × 10???）。人源同源基因MS4A6A在M2巨噬细胞中富集。
4. Ms4a6c?巨噬细胞通过Thbs1-Cd47轴与成纤维细胞存在增强的预测通讯
CellChat分析预测Ms4a6c?巨噬细胞参与广泛的信号网络，尤其与成纤维细胞的相互作用最为突出。Thbs1-Cd47轴具有最高的通讯概率。Ms4a6c?巨噬细胞共表达高水平的Ms4a6c和配体Thbs1，而受体Cd47广泛表达包括成纤维细胞。多色免疫荧光证实Ms4a6c、Thbs1和Cd47在纤维化生态位内空间共定位，为预测的旁分泌相互作用提供了原位证据。
5. 跨疾病分析和调控子推断鉴定Ms4a6c?巨噬细胞为候选保守促纤维化效应细胞，Cebpb为潜在上游调控因子
在肝硬化数据集（GSE136103）中，巨噬细胞亚聚类鉴定出7个群体，Ms4a6c样高评分巨噬细胞显示显著升高的EMT活性（Wilcoxon P = 3.6e-07）和TGF-β信号活性（Wilcoxon P = 1.5e-13）。在IPF数据集（GSE135893）中，9个巨噬细胞亚群中Ms4a6c高表达亚群同样显示显著更高的EMT和TGF-β活性（均P < 2e-16）。样本水平分析在CRP和IPF数据集中确认了这些差异，肝硬化数据集中TGF-β方向一致但未达显著（P = 0.088）。SCENIC调控子分析显示Ms4a6c?巨噬细胞对Maf、Cebpa、Bach1、Cebpb和Rel具有高特异性，其中Cebpb获得最高调控子特异性评分，提示其为候选上游转录因子。
6. 虚拟敲除预测促纤维化特征减弱并将MOTS-c列为候选配体
scTenifoldKnk单基因虚拟敲除模拟预测Ms4a6c敲除可导致转录组重编程，包括促纤维化特征预测性下调以及上皮基因Cdh1、Cldn7和Dstn的预测性上调。通路富集突出紧密连接和黏附连接通路。结构比对确认小鼠Ms4a6c与人MS4A6A之间的保守性。虚拟筛选从58,581个化合物中优先选出4个候选分子（MOTS-c、Omiganan、Kisspeptin、PKI）。100 ns MD模拟中，MOTS-c表现出优越的预测稳定性，具有低且收敛的RMSD（0.6–0.8 nm）、刚性的RMSF谱、稳定的回旋半径，并在自由能景观分析中维持单一深能量最小值。MOTS-c被确定为最高排名in silico筛选命中分子（AutoDock结合能?5.5 kcal/mol）。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究鉴定Ms4a6c为巨噬细胞特异性标志物，填补了辐射诱导肠道纤维化中免疫细胞群体认识的关键空白。Ms4a6c?巨噬细胞的混合激活状态挑战了传统M1/M2二分法，与组织巨噬细胞沿激活连续谱存在的观点一致。研究结果与多个器官中Trem2、SPP1或FABP5表达巨噬细胞亚群通过趋同的ECM重塑程序促进纤维化的发现相符，提示存在可靶向的共享机制。研究提出的Cebpb-Ms4a6c-Thbs1-Cd47轴为候选调控通路，其中THBS1激活潜伏TGF-β并与CD47或整合素受体相互作用促进成纤维细胞黏附、迁移和ECM产生，此机制在肝脏、肾脏和肺纤维化中已有阻断研究支持。MOTS-c作为线粒体衍生肽，其通过AMPK和Nrf2信号发挥代谢免疫调节作用，且近期研究显示其通过Nrf2通路减轻辐射诱导组织纤维化，使其成为值得深入研究的候选分子。
研究结论指出，本研究揭示Ms4a6c?巨噬细胞是慢性放射性直肠炎适应不良重塑的候选效应细胞。通过整合转录组学和计算建模以及肝硬化、特发性肺纤维化的跨疾病分析，研究人员鉴定出Cebpb-Ms4a6c-Thbs1-Cd47轴为可能跨器官系统保守的候选促纤维化信号级联。此外，MOTS-c作为计算预测的候选调控分子，为未来药理学研究提供了初步线索。这些发现开始揭示辐射损伤的细胞异质性，并为开发适用于多种纤维化疾病的靶向治疗提供了计算框架。未来结合遗传学和药理学功能验证的工作对于将这些计算发现转化为治疗策略至关重要。
