《Frontiers in Microbiology》：Copper and zinc from slurry applications shape grassland soil microbial community structure in a long-term experiment
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土壤微生物在维持土壤与植物健康以及保障农业生产力方面发挥着至关重要的作用。本研究针对位于北爱尔兰唐郡一块永久性草地上开展的历时约50年的长期粪浆定位试验，系统考察了含抗菌性铜（Cu）与锌（Zn）的牛粪浆和猪粪浆施用对土壤微生物群落结构的影响。研究人员采用Ill
土壤微生物在维持土壤与植物健康以及保障农业生产力方面发挥着至关重要的作用。本研究针对位于北爱尔兰唐郡一块永久性草地上开展的历时约50年的长期粪浆定位试验，系统考察了含抗菌性铜（Cu）与锌（Zn）的牛粪浆和猪粪浆施用对土壤微生物群落结构的影响。研究人员采用Illumina与PacBio rRNA测序技术（分别分析16S与ITS属水平）对试验各处理0–15 cm深度的土壤样品进行了分析。结果表明，粪浆类型与施用速率均显著改变了土壤微生物群落结构，其中最高施用速率处理下多数相对丰度变化呈现最大的log2倍数改变。与未施肥对照相比，最高粪浆处理下土壤pH（约6.5降至约5.8）与碳含量（约7%降至约5%）亦显著升高。置换检验显示，土壤pH、铜与锌浓度是驱动土壤微生物群落变化的关键因子（p < 0.001）。具体而言，铜主要影响细菌（16S；F ≈ 25）群落，而锌对真菌（ITS；F ≈ 13）属的影响最为显著。一项关键发现是，两类群落对粪浆管理的响应模式存在差异：主坐标典型分析（CAP）显示，16S群落结构同时受粪浆类型与施用速率影响而分化，而ITS群落结构仅由施用速率决定。尽管如此，研究未发现上述变化对牧草产量产生不利影响，且部分被促进的微生物（如Nitrospira spp.）与生产力提升相关联。然而，在所有处理中均检出的潜在致病菌（如Fusarium spp.）因其可产生污染性真菌毒素而值得关注。上述发现揭示了长期有机改良土壤中微生物群落的持续响应特征，此类响应在缺乏长期试验支撑的短期研究中难以观测。研究结果表明，长期施用含Cu与Zn的粪浆以显著方式重构了土壤微生物群落结构，这对抗菌素耐药性选择具有潜在影响，并提示其与真菌毒素相关食品安全问题之间可能存在关联，需在“全健康”（One Health）框架下将土壤、植物、动物与人类健康联系起来开展进一步研究。
长期粪浆施用重塑草地土壤微生物群落：基于北爱尔兰50年定位试验的多组学证据
一、研究背景与科学问题
爱尔兰岛温和的海洋性气候支撑着高产的草甸系统，为当地约850万头牛和超过250万头猪提供了优质饲草来源。伴随畜牧业的规模化发展，牛粪浆与猪粪浆作为有机肥料的产量持续增加，永久性草地正越来越多地转向以粪浆和厩肥为基础的有机施肥管理模式。此类措施不仅具有成本效益，还能减少对进口合成肥料的依赖，并有助于缓解富营养化压力；同时，其提升土壤有机碳（SOC）固持的潜力也成为农业碳达峰政策的重要考量。然而，土壤微生物在SOC稳定化中贡献了约40%的微生物残体碳（MRC），是有机碳长期存续的关键驱动者，但有机改良对微生物群落结构、MRC形成乃至SOC固持的影响程度，在西北欧温带草地系统中仍缺乏充分认识。
尤为关键的是，北爱尔兰一项历时50年的草地田间试验已表明，在高粪浆施用制度下，土壤微生物生物量出现下降，研究人员将其归因于土壤中锌（Zn）及潜在铜（Cu）的升高——这些金属源自动物饲料中为促生长而添加的药理学剂量抗菌剂。在“全健康”（One Health）框架下，长期Zn与Cu的富集会形成金属耐受微生物的选择性环境，建立土壤耐药性储库，并可能共选择更广泛的抗菌素耐药性。Zn毒性表现为广泛的生化干扰，可竞争性置换多种酶中的Mn、Mg和Fe，并与N、O、S基团形成强键；Cu则具有更强的化学活性，广泛用作杀真菌剂，其高氧化还原活性可诱发活性氧（ROS）、膜透化和DNA加合物损伤。在土壤中，Cu在酸性条件下较Zn更具移动性，且与溶解性有机碳（DOC）的结合亲和力显著高于Zn。已有短期研究（如5年铜污染试验、11年污泥添加试验）普遍报告了微生物生物量与活性的下降及群落向金属耐受方向的筛选，但其时间尺度限制了对外源金属长期效应的评估。基于此，本研究依托北爱尔兰希尔斯伯勒（Hillsborough）长期粪浆（LTS）试验，提出三个假设：H?——长期暴露已形成结构上独特的金属耐受微生物群落；H?——群落结构因养分来源与施用速率而异，反映牛、猪粪浆中Cu与Zn负载的差异；H?——单播草地与多物种混播草地（MSS）间的微生物群落响应存在差异。
二、研究设计与技术方法
该LTS试验自1970年起每年对48个小区（每小区29.75 m2）施用8种随机化养分处理，每种处理6个重复，包括牛粪浆和猪粪浆各以50、100、200 m3/ha/年施用，矿质肥（NPK，200、32、160 kg/ha/年）及未施肥对照。2019年9月，每种处理随机选取3个重复小区进行翻耕并重播多物种草甸（MSS，含黑麦草、白三叶、车前草和菊苣）。土壤样品于2021年10月采集至15 cm深度。研究人员采用Illumina双步骤扩增子测序对ITS区（引物ITS1F/ITS2R）进行测序，并利用PacBio Sequel IIe系统对16S rRNA全长基因测序；数据经QIIME2-2019.04流程处理，DADA2去噪生成扩增子序列变体（ASV），16S序列比对SILVA数据库（v138 SSU）、ITS序列比对UNITE数据库（v8）。化学分析包括EDTA提取态Cu与Zn的ICP-MS测定、能量色散X射线荧光（ED-XRF）测定15种元素、LECO分析仪测定总碳、1:2.5水土比测定pH。统计上采用双因素方差分析（ANOVA）、Dunnett检验、DESeq2（LRT与WALD检验）、Spearman相关分析、主坐标典型分析（CAP）及PERMANOVA（5,000次置换）。
三、主要研究结果
3.1 土壤化学特征
方差分析显示，EDTA提取态Cu与Zn浓度均因养分处理而显著差异（p < 0.001），但不受MSS影响。牛粪浆处理下土壤Cu生物有效性最高，Cow 200处理中位数约400 mg/kg，较对照与NPK（约50 mg/kg）高出一个数量级；猪粪浆处理Cu值均低于150 mg/kg。Zn趋势与Cu大致平行，但动物来源贡献相反——猪粪浆Zn含量更高，最高强度处理下中位数约300 mg/kg，对照与NPK约50 mg/kg。土壤总碳亦因养分处理显著差异（p < 0.001），牛粪浆支持了最大的长期碳积累（均值约7%），对照与NPK约5%。pH仅与MSS在0.05水平显著相关（F = 5.3），单播小区pH更低；养分处理对pH影响极显著（p < 0.001，F = 28）。
3.2 细菌与真菌属级相对丰度
PERMANOVA显示，长期养分处理对细菌（16S）与真菌（ITS）门和属级群落结构均有极显著影响（p < 0.001），养分处理解释了群落结构变异的较大比例（两者R2 > 0.66），强力支持H?。MSS虽为显著驱动因素，但效应量较小（真菌p < 0.001，细菌p < 0.05；R2分别约0.04和0.02），支持H?。CAP置换检验表明，16S属级群落中Cu（F ≈ 23.5，p < 0.001）、Zn（F ≈ 10.7，p < 0.001）、pH（F ≈ 2.8，p < 0.05）及组合效应均显著，但土壤碳不显著；真菌群落中Cu与Zn均显著（F分别约11.9和13.3，p < 0.001），pH与碳不显著。CAP图显示，16S数据按粪浆来源与施用速率分化：牛粪浆处理主要受Cu与pH驱动，猪粪浆处理主要由Zn区分；真菌数据则仅按施用速率分化，无粪浆来源分离。细菌门水平上，低量粪浆、对照与NPK处理聚集了放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和疣微菌门（Verrucomicrobiota），随粪浆负荷增加，厚壁菌门（Firmicutes）与Cu和土壤碳紧密关联，两种放线菌门与Zn最相关。真菌门水平上，对照、NPK与低量施用有利于担子菌门（Basidiomycota），高量施用下子囊菌门（Ascomycota）相对丰度变化更显著。
属级Log2FC比较显示，受牛粪浆200处理负面影响最大的细菌为Subgroup 2（Log2FC ?4.27；相对丰度由对照0.76%降至0.04%）和Candidatus Xiphinematobacter spp.（Log2FC ?3.99；0.47%降至0.03%），两者与Cu呈最强负相关（R分别为?0.80与?0.81）。相对丰度增加最显著的是Nocardia spp.（Log2FC 9.73；<0.001%升至1.02%）和Nitrospira spp.（Log2FC 8.25；0.006%升至1.36%）。与Cu相关性最强的为两种厚壁菌门Romboutsia spp.（R = 0.93）和Turicibacter spp.（R = 0.95）。真菌中，Archaeorhizomyces spp.（Log2FC ?12.9；34.5%降至0.004%）和Clavaria spp.（Log2FC ?14.8；2.35%降至<0.001%）受猪粪浆200影响最大；Fusarium spp.在牛与猪处理中均大幅增加（Log2FC分别为8.99和9.23；<0.001%升至0.26%和0.12%），Preussia spp.（Log2FC 9.74；0.004%升至0.63%）在牛处理中最高，Arthrographis spp.（Log2FC 9.81；<0.001%升至0.08%）在猪处理中最高。在41个入选属中，25个分类单元相对丰度随粪浆施用而增加，16个下降；牛粪浆处理效应比猪粪浆更普遍。牧草产量在最高养分负荷处理中最高，与Nitrospira spp.和Rhodococcus spp.（细菌）及Fusarium spp.和Arthrographis spp.（真菌）呈最强正相关。
四、讨论与结论
讨论部分指出，长期粪浆施用导致土壤Cu与Zn富集，并强烈塑造了草地土壤微生物群落结构。动物消化道来源的厚壁菌门（如Romboutsia和Turicibacter）在牛粪浆处理中相对丰度更高，提示反刍动物微生物组对土壤群落结构的塑造作用可能更为显著，支持H?。Nocardia和Rhodococcus等已知金属耐受菌与Cu、Zn浓度强相关，后者可通过膜生物吸附实现解毒。Nitrospira作为化能自养硝化菌，在高氮添加处理中富集。真菌中，Arthrographis在有机质活跃分解处丰度高，Preussia的生命周期涉及动物摄食传播孢子，Iodophanus在粪肥与腐殖质丰富土壤中繁盛。特别值得关注的是，Fusarium在锌富集处理中相对丰度最高，且与锌的相关性强于任何其他分类单元，鉴于其产毒种可导致真菌毒素污染——青贮草尤其易受影响——这一发现提示锌富集可能增加真菌毒素相关食品安全风险。相反，Subgroup 2、IMCC26256、Candidatus Xiphinematobacter等细菌及Entoloma、Clavaria、Archaeorhizomyces等真菌更偏好低投入、低产量环境，可能反映基线土壤生物多样性。研究人员强调，上述Cu、Zn与微生物群落的关联应视为相关性而非因果性，因为粪浆同时改变了多种土壤性质，且粪浆自身携带的微生物组和未纳入考量的药物添加剂可能施加独立选择压力。
结论部分总结道：高粪浆施用速率（200 m3/ha/年）富集了包括氮循环相关微生物（如Nitrospira spp.）和潜在致病菌（如Fusarium spp.）在内的若干属级类群；土壤Cu、Zn与pH显著改变微生物相对丰度，导致细菌与真菌群落变化；MSS翻耕与重播引起的土壤扰动在两年后未对微生物群落产生显著影响。虽然高粪浆速率通过提高产量带来农艺效益，但长期改变了土壤微生物群落与土壤健康。养分处理类型对ITS群落结构影响不显著，但对16S群落呈现清晰分化；而养分处理量主要改变ITS群落。研究强调，需在“全健康”框架下审慎管理粪浆施用速率以平衡生产力与可持续性，因为金属累积仍在持续；将土壤微生物组认知纳入可持续养分管理策略，对于维持支持“全健康”的韧性农业生态系统至关重要。
