BKPyVN相关巨噬细胞亚群与ATF4/MCL1诊断生物标志物鉴定：整合机器学习和单细胞分析

《Frontiers in Immunology》：BKPyVN-associated macrophage subpopulations and diagnostic biomarker identification - combine machine learning with single-cell analysis

背景：作为固有免疫的关键效应细胞，巨噬细胞可能在肾移植后BK多瘤病毒肾病（BK polyomavirus nephropathy, BKPyVN）的免疫调节和纤维化重塑中发挥关键作用。然而，其亚群异质性、分子特征和功能机制仍知之甚少。
方法：研究人员整合了BKPyVN与稳定移植肾（stable transplant kidney, STK）活检的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据。采用拟时序轨迹、CellChat和高维加权基因共表达网络分析（high-dimensional weighted gene co-expression network analysis, hdWGCNA）来表征BKPyVN相关巨噬细胞（BKPyVN-associated macrophages, BKPyVN-Mac）并鉴定相关基因模块。来自这些模块的特征基因用于从整合的肾同种异体移植微阵列数据集构建诊断模型，并比较了九种机器学习算法。关键基因在人活检中通过RT-qPCR和免疫组织化学（immunohistochemistry）验证，并在持续性小鼠多瘤病毒（mouse polyomavirus, MPyV）感染模型中通过时间过程转录本和蛋白分析验证。
结果：BKPyVN-Mac占据疾病相关巨噬细胞状态，并可能作为同种异体移植微环境内的中心通讯枢纽。支持向量机（support vector machine, SVM）模型表现出最佳诊断性能，具有最高的受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve, AUC = 0.923）。ATF4和MCL1被鉴定为关键特征基因，其上调在人BKPyVN活检中得到证实，并通过其小鼠直系同源基因Atf4和Mcl1在持续性MPyV感染模型中得到证实。功能分析提示这些基因与炎症、纤维化重塑和代谢调节相关。
结论：本研究表征了BKPyVN-Mac亚群的分子表型和调控网络，为BKPyVN病理生理学提供了新见解，并鉴定了用于临床诊断的候选生物标志物。

BKPyVN是肾移植后肾同种异体移植物功能障碍和失功的主要原因之一。目前缺乏特异性抗病毒治疗，临床管理主要依赖监测BKPyV复制和降低免疫抑制，但降低免疫抑制可能增加同种免疫损伤风险；早期BKPyVN因临床和病理表现非特异，难以与其他移植后并发症区分。因此，深入理解BKPyVN免疫微环境并鉴定稳健疾病相关生物标志物是重要临床需求。巨噬细胞是固有免疫关键调节细胞，可能参与BKPyVN发生发展，但既往多研究批量巨噬细胞浸润或一般免疫功能，其亚群异质性、疾病相关分子特征、亚群特异功能角色及诊断生物标志物仍不清楚。scRNA-seq可高分辨率刻画单细胞基因表达，故研究人员整合BKPyVN和STK scRNA-seq，用hdWGCNA鉴定共表达模块，结合外部微阵列和机器学习鉴定特征基因并实验验证。

主要关键技术方法：研究人员采集5例STK和9例BKPyVN活检进行scRNA-seq；从GEO获取GSE47199、GSE72925、GSE75693三个微阵列数据集，共119例，包括30例BKPyVN和89例STK，用ComBat校正批次。分析采用Seurat、DoubletFinder、Harmony、Monocle2拟时序、CellChat、hdWGCNA、CIBERSORT、ssGSEA、scTenifoldKnk虚拟敲除，并比较SVM、PLS、DTS、Logistic Regression、KNN、GBM、NeuralNet、glmBoost和XGBoost九种机器学习算法。实验验证包括人肾活检RT-qPCR和免疫组织化学，以及2周龄雄性C57BL/6小鼠持续性MPyV感染模型（4 × 10⁶ copies/mL，采集3、10、24、35、60、80 dpi样本），进行病毒载量qPCR、Western blot和RT-qPCR。

研究结果：
3.1 Single-cell RNA sequencing characterizes the cellular atlas of BKPyVN：质控后保留44,459个高质量细胞，鉴定14个主要细胞群，包括近端小管细胞（PTC）、亨利环细胞（LOH）、集合管细胞（CD）、B细胞（B）、自然杀伤细胞（NK）、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、髓系细胞（MD）、肥大细胞（MT）、中性粒细胞（NE）、内皮细胞（EC）、成纤维细胞（FB）、浆细胞（PC）和周期细胞（CC）；髓系细胞在STK和BKPyVN间相对丰度差异明显。
3.2 Single-cell RNA sequencing analysis reveals the heterogeneity of myeloid cells in BKPyVN：髓系细胞二次聚类得到12个亚群，包括6个巨噬细胞亚型（Macro1–Macro6）、4个树突状细胞亚型（pDC、cDC1–cDC3）和2个单核细胞亚型（Mono1–Mono2）；Macro1、Macro3、Macro4在BKPyVN增加，定义为BKPyVN-Mac。其标记基因包括OLR1、TAP1、CXCL9、GBP5、STAT1、FN1、IL1RN、LGALS3、CLEC4E，提示干扰素相关抗病毒反应、抗原加工呈递、巨噬细胞活化、黏附和组织重塑；BKPyVN-Mac扩张与临床疾病进展正相关，从STK到AST Stage B1持续增加并在AST Stage B2达峰；GO富集于细胞质翻译、淋巴细胞活化、白细胞活化、细胞杀伤、细胞-基质连接和钙黏蛋白结合。
3.3 BKPyVN-Mac: pseudotime trajectory and cellular communication：Monocle2显示BKPyVN-Mac在发育轨迹中位置独特，形成于轨迹起始及分支2和1；CellChat显示BKPyVN组织比STK有更多推断细胞互作和更高总体互作强度，BKPyVN-Mac与多个细胞群互作更强，传入和传出信号更强，ADGRE、SPP1、FN1、ANNEXIN、SELL和ANGPTL通路活性更高。研究人员据此总结BKPyVN-Mac并非单纯扩张的巨噬细胞群，而是疾病相关巨噬细胞状态，可能由持续多瘤病毒相关免疫刺激塑造，ADGRE/SELL和SPP1/FN1信号可能连接黏附募集、炎症串扰和组织重塑。
3.4 HdWGCNA reveals module hub genes in BKPyVN-Mac：hdWGCNA选择β = 3，构建15个共表达模块，其中MD2、MD4、MD9、MD13和MD14与BKPyVN-Mac关联最强；MD8、MD2、MD6、MD10、MD12和MD11形成高度相关模块簇，MD4、MD13、MD9和MD14形成另一相关模块簇；并展示各模块按kME排序的枢纽基因。
3.5 Identification of diagnostic signature genes for BKPyVN through integrative transcriptomic analysis and machine learning：批次校正有效降低整合微阵列数据批次效应；对MD2、MD4、MD9、MD13和MD14模块来源基因进行差异表达分析，GO富集于蛋白合成、RNA结合与加工、凋亡调节、细胞黏附和细胞连接组织。九种机器学习算法比较中，SVM在独立测试集AUC最高（AUC = 0.923），开发集重复交叉验证平均AUC为0.9089 ± 0.0921，与PLS平均交叉验证AUC（0.9127 ± 0.0782）相当，SVM独立测试AUC与交叉验证均值差为0.0142。SVM top特征基因为ATF4、CD63、C16orf72、GNS、MCL1、ATP6V1B2、EIF4A2、CD48、HLA-A和PPP1R15B；排列贡献分析进一步量化其模型贡献。
3.6 Distinct immune cell infiltration landscape and exploratory gene–immune cell associations in BKPyVN：CIBERSORT估计BKPyVN样本中CD8⁺ T细胞、活化记忆CD4⁺ T细胞和M1巨噬细胞比例显著高于STK；M1巨噬细胞比例与单核细胞正相关，与naive CD4⁺ T细胞和naive B细胞负相关，M2巨噬细胞比例与滤泡辅助性T细胞和调节性T细胞负相关。关键特征基因与免疫细胞比例的关联在未校正P值下呈名义关联，但经Benjamini–Hochberg校正后不显著，因此被解释为探索性趋势。
3.7 Identification of BKPyVN pathway signatures using ssGSEA and functional annotation of key genes：ssGSEA显示BKPyVN与STK间通路活性广泛差异，主要富集于免疫炎症和抗病毒程序，包括干扰素反应、IL6–JAK–STAT3信号、经NF-κB的TNFA信号、补体激活、炎症反应和同种异体移植排斥；凋亡、p53通路、活性氧通路和DNA修复等细胞应激与损伤通路也改变。ATF4主要与缺氧、p53通路、凋亡、上皮–间充质转化和顶端连接等应激及损伤/重塑通路相关，并与脂肪酸代谢和氧化磷酸化等代谢程序负相关；MCL1与同种异体移植排斥、炎症反应、IL6–JAK–STAT3、经NF-κB的TNFA、干扰素反应、补体激活、凋亡和PI3K–AKT–mTOR信号等免疫炎症与生存通路正相关。线性回归进一步量化这些关联，支持优先验证ATF4和MCL1。
3.8 Experimental validation of ATF4/MCL1 expression in polyomavirus infection：研究人员建立持续性MPyV感染模型，血液病毒载量在24 dpi达峰后降至检测限以下，肾脏病毒载量在35 dpi达峰后持续高，确认持续性肾脏感染。Western blot显示ATF4蛋白在24 dpi诱导并持续升高，后期略降；MCL1蛋白在24 dpi明显升高并持续。RT-qPCR显示Atf4 mRNA感染后显著升高，24 dpi相对诱导最强，80 dpi仍高于时间匹配模拟感染对照；Mcl1 mRNA亦上调并在感染晚期维持。人BKPyVN活检中ATF4和MCL1 mRNA较STK显著上调，免疫组织化学显示BKPyVN中ATF4和MCL1免疫反应更强更广泛。
3.9 Virtual gene knockout analysis of ATF4 and MCL1：scTenifoldKnk虚拟敲除显示，ATF4敲除后179个基因显著差异调控，top扰动基因包括SRGN，代谢相关NAMPT、ECHS1及抗原呈递相关HLA-DRA、CD74、HLA-DRB1；GO富集于小分子、有机酸和氨基酸分解，线粒体内膜、MHC II类蛋白复合物、氧化还原酶活性和NAD结合。MCL1虚拟敲除扰动更局限，仅7个基因显著差异调控，其中DUSP2和DUSP4明显扰动，CXCR4、NR4A2和CREM也变化。上述为计算预测。

讨论部分总结：讨论指出移植后BKPyVN以持续病毒感染和宿主免疫失调驱动的慢性炎症为特征，可能形成病毒复制与炎症自我延续循环，导致移植物进行性损伤。BKPyVN-Mac与肾脏损伤、纤维化和移植炎症中报道的巨噬细胞状态共享活化、黏附和组织重塑特征，但突出干扰素激活和抗原加工特征。GO提示其促炎和促黏附表型，可能参与淋巴细胞募集和活化；细胞–基质连接和钙黏蛋白结合提示黏附和局部滞留。拟时序和CellChat提示BKPyVN-Mac是炎症通讯枢纽，ADGRE/SELL信号与黏附、迁移、滞留和免疫细胞募集相关，SPP1/FN1信号连接细胞外基质重塑和成纤维细胞活化。hdWGCNA提示蛋白合成、RNA结合加工、凋亡调节和细胞黏附相关转录程序。SVM诊断模型AUC = 0.923提示BKPyVN-Mac分子签名可作为区分BKPyVN与STK的候选组织分子辅助，但由于源于肾移植转录组数据，尚不能视为已建立的非侵入诊断或早期预警工具。ATF4和MCL1通路关联互补，ATF4关联整合应激反应和组织损伤/重塑，MCL1关联抗凋亡生存和炎症程序。研究人员提出一个假说模型：持续BKPyV复制使移植物微环境暴露于病毒抗原、干扰素相关炎症信号和细胞应激线索，促进巨噬细胞向BKPyVN相关状态转变，ATF4和MCL1相关程序支持巨噬细胞维持，ADGRE/SELL和SPP1/FN1相关信号连接炎症募集与细胞外基质重塑。MPyV模型作为简化系统，不包含移植和免疫抑制因素，用于分离自然病毒定植下的宿主反应；其验证了ATF4/MCL1诱导。虚拟敲除提示ATF4可能协调应激适应免疫代谢程序，MCL1可能支持生存并通过DUSP2/DUSP4调节MAPK反馈。局限性包括MPyV模型不能完全复现移植后BKPyVN；虚拟敲除为计算预测；研究主要聚焦巨噬细胞，需进一步研究多细胞互作。

结论翻译：总之，本研究基于单细胞转录组分析，将BKPyVN-Mac鉴定为与BKPyVN促炎和促纤维化微环境相关的疾病相关巨噬细胞群体。通过将hdWGCNA与机器学习相结合，研究人员开发了性能良好的基于SVM的诊断模型（AUC = 0.923），并鉴定了一个核心五基因特征，其中ATF4和MCL1成为应激和生存相关特征基因。ATF4和MCL1的相关性进一步得到人转录组分析、肾同种异体移植活检中RT-qPCR和免疫组织化学验证，以及持续性MPyV感染模型中时间过程转录本和蛋白分析的支持。这些发现为与BKPyVN相关的免疫代谢和应激适应程序提供了新见解，并支持ATF4和MCL1作为未来验证的候选诊断生物标志物。