基于比色LAMP与简化DNA制备方法检测牛乳中大肠杆菌的研究

《Veterinary Research Communications》：Colourimetric LAMP detection of Escherichia coli in bovine milk using a simplified DNA preparation method

　　

大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）是牛乳房炎（bovine mastitis）的常见病原体，从乳样中快速检出该菌对于疾病的及时处置至关重要。然而，比色环介导等温扩增（colourimetric loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等分子检测方法常受限于依赖实验室的DNA提取步骤。本研究评估了一种简化的HotSHOT（HS）DNA制备方法用于从牛乳中提取大肠杆菌DNA，并检验其与比色LAMP及常规聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的兼容性。研究人员使用人工添加大肠杆菌的巴氏杀菌牛乳进行分析性能评价，并使用培养阳性的临床乳样评估诊断性能。HS方法与五种商品化DNA提取试剂盒以及一种不经离心的直接煮沸法进行了比较。性能以检出限（limit of detection，LOD）表示，单位为菌落形成单位每毫升（colony-forming units per millilitre，CFU/mL）。采用HS方法时，LAMP的LOD为7.9×10⁴ CFU/mL，PCR的LOD为7.9×10³ CFU/mL。HS方法的PCR性能与QIAamp和Norgen商品化试剂盒相当，而LAMP敏感性比最优试剂盒法低10至100倍。直接煮沸法显示敏感性显著降低，其LOD为7.9×10⁸ CFU/mL。在17份培养确诊为大肠杆菌阳性的临床乳房炎乳样中，LAMP检出15份（88.2%），PCR检出全部17份（100%）。这些结果表明，简化的DNA制备方法可支持牛乳中大肠杆菌的分子检测，并为未来在资源受限环境中开发可现场部署的诊断技术提供实践基础。

牛乳房炎（bovine mastitis）是奶牛养殖业面临的重大健康挑战，可导致产奶量下降、动物福利受损及抗菌药物使用增加。细菌培养虽是鉴定乳房炎病原体的参考方法，但耗时较长，且乳样通常需运送至诊断实验室，导致治疗决策常被延误或在病原鉴定前即作出。加州乳房炎试验（California Mastitis Test）和体细胞计数等方法虽能识别乳腺炎症，却无法确定致病菌种类，易造成非特异性治疗和抗菌药物过度使用。分子诊断技术如常规聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）虽可从乳样中实现敏感特异的病原检测，但依赖热循环仪、稳定电源和专业人员，限制了其在实验室外及农场现场的常规应用。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）因可在等温条件下运行且无需复杂仪器，成为分散化检测的实用替代方案；比色LAMP（colourimetric LAMP）的开发进一步通过颜色变化实现肉眼判读结果，无需浊度测定、荧光检测或凝胶电泳等额外设备。然而，分子检测性能强烈依赖于提取DNA的质量，而DNA提取常是分子诊断中最关键且最受限的步骤。快速DNA制备法可能含有抑制扩增的杂质；商品化试剂盒虽能提供高质量DNA，但需实验室设备、多种试剂和较高成本。这一矛盾限制了分子诊断在非实验室环境中的推广应用。本研究旨在开发并评估一种用于检测牛乳中大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）的比色LAMP方法，并检验其与简化HotSHOT（HS）DNA制备法的兼容性，同时以五种商品化DNA提取试剂盒和一种直接煮沸法作为对照，系统评估该方法在人工污染乳样和临床乳样中的分析性能与诊断效能。

研究人员使用商业巴氏杀菌全脂牛乳制备大肠杆菌人工污染样本，将过夜培养的菌液进行十倍梯度稀释（10^-1至10^-10），并通过平板菌落计数确定各稀释度的活菌浓度（CFU/mL）。DNA提取方面，优化后的HS法采用含0.2 mM乙二胺四乙酸二钠（disodium EDTA）和25 mM氢氧化钠（NaOH）的裂解液（pH 12.0）及含40 mM Tris-HCl的中和液（pH 1.9），将150 μL乳样与75 μL裂解液混合后于90 °C加热10 min，再加入75 μL中和液，全程无需离心。对照方法包括五种商品化试剂盒（QIAamp DNA Microbiome Kit、Milk Bacterial DNA Isolation Kit、Quick DNA Fecal/Soil Microbe DNA Miniprep Kit、ReliaPrep Blood gDNA Miniprep System、Wizard Genomic DNA Purification Kit）以及一种不经离心的直接煮沸法（100 °C加热10 min）。靶标基因为大肠杆菌特异的uidA基因（编码β-葡萄糖醛酸酶，GenBank登录号KT311783.1），LAMP引物组包含外引物EC-F3/EC-B3、内引物EC-FIP/EC-BIP及环引物EC-LF/EC-LB；EC-F3和EC-B3同时用作常规PCR引物，扩增产物大小为207 bp。比色LAMP反应使用经修饰的WarmStart? Colourimetric LAMP 2× Master Mix，于65 °C孵育60 min（HS法提取的DNA延长至90 min），阳性结果通过反应液由粉红色变为黄色判读。常规PCR使用GoTaq Green Flexi体系，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳和GelRed染色后于紫外下观察。临床验证使用来自澳大利亚Elizabeth Macarthur农业研究所的17份培养阳性乳样，其大肠杆菌身份经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）确认。特异性评价采用11种非目标菌株（包括Streptococcus uberis、Pasteurella multocida、Staphylococcus aureus等），并结合BLASTn进行引物体外（in silico）比对分析。检出限（LOD）定义为三个技术重复中至少两个产生阳性结果的最低细菌浓度。

**比色LAMP与PCR检测方法的建立与优化**
在优化条件下，比色LAMP检测大肠杆菌DNA时出现从粉红色到黄色的清晰颜色变化，阴性对照无颜色变化；常规PCR使用EC-F3/EC-B3引物可稳定扩增出预期的207 bp产物，阴性对照无扩增条带，证明两种检测方法均功能正常，可用于后续分析评价。

**不同DNA提取方法比较及检出限测定**
三种技术重复的LOD值在各方法间相差不超过一个稀释度。使用优化的HS法时，比色LAMP检测大肠杆菌的LOD约为7.9×10⁴ CFU/mL，PCR的LOD约为7.9×10³ CFU/mL。QIAamp DNA Microbiome Kit和Milk Bacterial DNA Isolation Kit的PCR LOD与HS法相当（7.9×10³ CFU/mL），但LAMP LOD低十倍（7.9×10³ CFU/mL）。Quick DNA Fecal/Soil Microbe DNA Miniprep Kit的LOD较高，LAMP为7.9×10⁵ CFU/mL，PCR为7.9×10⁴ CFU/mL。ReliaPrep Blood gDNA Miniprep System和Wizard Genomic DNA Purification Kit灵敏度最高，LAMP LOD为7.9×10² CFU/mL，PCR为7.9×10¹ CFU/mL。直接煮沸法两种检测的LOD均为7.9×10⁸ CFU/mL，显著高于其他方法数个数量级。

**临床样本验证与诊断敏感性**
使用优化的HS法提取17份培养确诊为大肠杆菌阳性的临床乳房炎乳样DNA后，比色LAMP检出15份阳性，诊断敏感性为88.24%（95% CI: 0.63–0.98）；常规PCR检出全部17份阳性，诊断敏感性为100%。两种检测的阴性对照均未出现假阳性反应。

**特异性评价**
比色LAMP和PCR对11种非目标细菌均无交叉反应，仅大肠杆菌呈阳性结果。对部分PCR扩增产物进行测序，确认其为大肠杆菌序列（NCBI登录号PV472575–PV472578）。体外（in silico）分析显示，两条外引物与大肠杆菌序列完全匹配（100%同一性），与志贺氏菌（Shigella）存在全长匹配，但与肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、柠檬酸杆菌（Citrobacter）和粘质沙雷菌（Serratia marcescens）仅存在部分比对，无全长匹配，未发现对乳房炎相关肠杆菌科病原的非特异性扩增风险。

**讨论**
研究结果表明，优化的HS法提取的DNA可同时满足LAMP和PCR检测牛乳中大肠杆菌的质量要求，其LOD与多种商品化试剂盒相当。直接煮沸法效果极差（LOD达10⁸ CFU/mL），说明单纯加热无法从乳中释放可扩增的DNA，HS法中碱性裂解与中和步骤是关键因素；高LOD可能源于乳脂、蛋白及二价阳离子对扩增的抑制，而非煮沸本身。HS法操作成本约为每样本0.50澳元，远低于商品化试剂盒的6至22澳元，且无需离心设备。尽管LAMP敏感性低于PCR，但两种方法检测范围均在10³–10⁴ CFU/mL水平，低于临床活动性乳房炎相关的细菌计数阈值（>1×10⁵ CFU/mL），适合临床乳房炎快速检测。在17份临床样本中LAMP漏检2份，提示低菌载量或抑制物仍会影响比色判读，此时实验室qPCR更适用。研究局限性包括临床样本量较小、未包含培养阴性及混合感染样本、未在真实农场条件下评估，以及比色终点在低浓度时可能存在判读主观性。总体上，HS法结合比色LAMP在分析性能与操作简便性之间取得了平衡，可减少对实验室基础设施和专业人员的依赖，具备作为近场或现场诊断工具的潜在应用价值。

**结论**
这项研究表明，将基于颜色变化的LAMP检测与HS DNA制备方法相结合，可在分析性能与操作简便性之间提供一种平衡的方案。虽然PCR仍然更为敏感，但HS-LAMP工作流程降低了对实验室基础设施、专用设备和培训人员的依赖，支持其作为近场或现场诊断工具的潜在应用前景。