CHCHD2通过维持线粒体-溶酶体轴稳态缓解年龄相关蛋白稳态崩溃并抵御LBD样病理

《Acta Neuropathologica》：CHCHD2 mitigates age-associated proteostatic collapse by maintaining homeostasis of the mitochondria-lysosome axis

　　

含卷曲螺旋-螺旋-卷曲螺旋-螺旋结构域蛋白2（coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2, CHCHD2）的突变，包括与帕金森病（Parkinson’s disease, PD）相关的CHCHD2^T61I突变，通过未知机制与Lewy体疾病（Lewy body disorders, LBDs）相关。在此，研究人员证明，CHCHD2^T61I通过破坏线粒体-溶酶体轴（mitochondria-lysosome axis）加剧年龄相关脑病理，包括轴突变性和认知缺陷。具体而言，CHCHD2^T61I结合并降低组织蛋白酶B（cathepsin B, CTSB）和组织蛋白酶L（cathepsin L, CTSL）水平，诱导溶酶体膜通透性（lysosomal membrane permeability）并损害α-突触核蛋白（α-synuclein, αSyn）纤维清除。研究人员还证明，人类CHCHD2在脑内随年龄下降，而野生型CHCHD2表达可防御年龄相关神经炎症、多巴胺能神经元丢失、不溶性蛋白聚集以及线粒体和溶酶体结构恶化。这些发现，结合在人类LBD脑内观察到的CTSB和CHCHD2降低，确立CHCHD2是通过线粒体-溶酶体轴维持神经元对衰老和蛋白稳态崩溃（proteostatic collapse）具有韧性的关键调节因子。防止年龄相关的CHCHD2下降提供了在整个衰老过程中保护脑健康的治疗策略。

论文主体解读

研究背景与问题：Lewy体疾病（Lewy body disorders, LBDs）包括帕金森病（Parkinson’s disease, PD）和痴呆伴Lewy体，其核心病理为α-突触核蛋白（α-synuclein, αSyn）在Lewy体中年龄相关积累。线粒体和溶酶体功能障碍是LBD发病的重要驱动因素，并与αSyn病理及正常脑老化交叉。病理αSyn可结合线粒体外膜转位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20, TOM20），损害线粒体蛋白输入和复合体I活性；溶酶体介导的线粒体自噬随年龄下降，PINK1、PARKIN突变及GBA、ATP13A2、TMEM175、CTSB等溶酶体基因变异进一步加重PD风险；病理αSyn还可通透化溶酶体膜，破坏溶酶体外排并促进错误折叠αSyn聚集。尽管如此，线粒体-溶酶体轴与LBD进展之间的机制仍不清楚。含卷曲螺旋-螺旋-卷曲螺旋-螺旋结构域蛋白2（coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2, CHCHD2，简称D2）是线粒体膜间隙（intermembrane space, IMS）蛋白，调节电子传递链、嵴完整性和凋亡。PD相关D2^T61I和D2^R145Q与常染色体显性PD共分离，20余个D2突变与LBD相关。D2^T61I患者可见黑质神经退变、L-DOPA反应性运动缺陷，并存在超出LBD的病理，如神经原纤维缠结和淀粉样β斑块。既有D2^T61I小鼠可重现突触丢失、神经炎症、线粒体聚集、多巴胺能神经退变和αSyn积累，但D2^WT是否可保护年龄相关退化、D2与溶酶体蛋白酶降解的关系尚未被探索。因此，研究人员开展本研究。

研究策略、主要结论与意义：研究人员建立表达人D2^WT的转基因小鼠，并与D2^T61I及野生型小鼠比较，结合蛋白质组、互作组、机制实验和人尸检组织分析。研究发现，人类脑内D2随年龄下降；D2^WT表达可抵抗年龄相关神经炎症、多巴胺能神经元丢失、不溶性蛋白聚集以及线粒体和溶酶体结构恶化；D2^T61I通过破坏线粒体-溶酶体轴加剧轴突变性和认知缺陷，并优先结合并降低CTSB和CTSL，诱导溶酶体膜通透性，损害αSyn纤维清除。人类LBD脑内CTSB和D2降低。研究确立D2为神经元对衰老和蛋白稳态崩溃韧性的关键调节因子，提示防止年龄相关D2下降是保护脑健康的治疗策略。该论文发表在《Acta Neuropathologica》。

关键技术方法概括：研究使用C57BL/6J背景的D2^WT和D2^T61I转基因小鼠，品系已存于The Jackson Laboratory，编号039978和039979；分析公开人脑皮质微阵列数据集GDS5204（Lu et al.，41例，年龄24–106岁）；使用人皮质LBD患者9例和年龄匹配对照8例。主要技术包括行为学新物体识别和开场实验、离体电生理记录输入-输出、配对脉冲易化和长时程增强、免疫印迹和免疫组化、RIPA与Sarkosyl分级提取、线粒体亚组分和溶酶体分离、LC-MS/MS蛋白质组和BioID互作组、邻近连接测定（proximity ligation assay, PLA）与共免疫沉淀、组织蛋白酶活性测定、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）以及αSyn预形成纤维（preformed fibrils, PFFs）清除实验。

研究结果：
CHCHD2表达在人脑中随年龄下降。通过分析公开人脑皮质微阵列数据集，研究人员发现20至100岁期间Chchd2基因表达显著年龄依赖性下降，两性均存在，女性回归斜率更陡且统计显著性更强；该结果与老年D2缺陷小鼠的多巴胺能神经元丢失、线粒体碎片化和SQSTM1/p62包涵体表型一致，提示年龄相关D2下降可能增加LBD易感性。

CHCHD2线粒体定位与D2^WT小鼠突触可塑性完整。研究人员用mPrP启动子生成脑特异性表达人Flag-D2^WT的小鼠，qRT-PCR显示12月龄D2^WT脑内Chchd2转录本较WT增加约2.3倍；5月龄D2^T61I多个中枢神经系统区域Flag-D2蛋白较D2^WT少约50%。D2^WT幼鼠无异常表型、体重正常，12月龄脑和脊髓形态正常，18月龄皮质、中脑、海马和脊髓广泛表达。线粒体亚组分显示Flag-D2^WT主要定位于IMS；12月龄海马突触素强度不变，10月龄输入-输出、配对脉冲易化和长时程增强均正常，而D2^T61I存在损害。

CHCHD2^T61I而非CHCHD2^WT小鼠表现认知缺陷。18月龄新物体识别测试中，WT和D2^WT小鼠辨别指数约0.7，D2^T61I小鼠低于0.6并接近随机水平，表明识别记忆严重损害；开场实验未显示运动或焦虑样行为差异。12月龄D2^T61I小鼠情境恐惧条件化正常，提示18月龄时出现年龄相关恶化。

CHCHD2^WT减轻年龄相关神经炎症、多巴胺能神经元丢失和不溶性蛋白病。12月龄D2^WT小鼠Iba1和GFAP免疫反应性无变化；18月龄D2^WT小鼠Iba1和GFAP显著低于同龄WT和D2^T61I；D2^T61I小鼠18月龄Iba1升高而GFAP不变。12月龄D2^WT小鼠黑质酪氨酸羟化酶阳性（tyrosine hydroxylase-positive, TH⁺）多巴胺能神经元数量较WT增加；18月龄D2^T61I小鼠黑质银染阳性退变轴突较WT和D2^WT近2倍，并出现D2聚集样包涵体。蛋白质组分析显示，12月龄D2^WT小鼠皮质不溶性/可溶性蛋白比值降低，而D2^T61I脑内不溶性蛋白显著增加。

CHCHD2^T61I破坏脑内线粒体-溶酶体轴。对12月龄D2^T61I与D2^WT小鼠皮质可溶性蛋白进行LC-MS/MS和Ingenuity Pathway Analysis，发现前30条经典通路中三大主题显著改变：线粒体脂肪酸β氧化、脂肪酸活化、亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸降解和L-肉碱穿梭；协调性溶酶体表达和调控（Coordinated Lysosomal Expression And Regulation, CLEAR）信号通路及内吞通路；整合应激反应和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）相关通路，包括EIF2、EIF4、p70S6K和mTOR。CLEAR信号被抑制，脂肪酸β氧化和EIF2信号被激活。D2^T61I脑内CTSB、CTSL和己糖胺酶A（HEXA）显著降低，CTSL经免疫印迹确认；LAMTOR3和Rab39A在D2^T61I脑内检测不到，而D2^WT可检测。未发现溶酶体蛋白上调，提示溶酶体稳态呈单向受损。

CHCHD2^T61I优先结合并抑制CTSB和CTSL溶酶体蛋白酶。通过BioID互作组筛选，研究人员将D2靶向IMS，在HT22小鼠海马神经母细胞瘤稳定细胞中鉴定D2^T61I与D2^WT差异互作蛋白，D2^T61I拉下物中包括CTSB。PLA显示D2^T61I与内源性CTSB和CTSL互作显著强于D2^WT，约为1.5–2倍，且D2-CTSL复合物不与健康低pH溶酶体共定位；共免疫沉淀也证实该相互作用。10月龄D2^T61I前脑CTSB和CTSL活性显著低于WT和D2^WT，而CTSD活性不变。

LBD脑和CHCHD2^T61I转染细胞中CTSB和CTSL降低。对人皮质LBD患者和年龄匹配对照进行Sarkosyl提取，LBD患者可溶性D2降低约65%，CTSB降低约45%，CTSL降低约25%但未达统计学显著，CTSD不变；D2与CTSB水平显著正相关，与CTSL和CTSD无显著相关。HT22细胞中，D2^T61I分泌较D2^WT减少超过80%，RIPA不溶性D2^T61I聚集增加，可溶性D2^T61I降低；可溶性CTSB和CTSL在D2^T61I表达细胞中显著降低，CTSD不变。HEK293T细胞中重复出相似结果。

CHCHD2^T61I溶酶体积累加剧溶酶体膜通透性和空泡化，阻碍αSyn纤维清除。从10–12月龄小鼠脑内分离溶酶体后，D2^T61I不溶性部分在溶酶体组分中显著高于D2^WT，尽管总裂解物中D2^T61I降低。重组D2^T61I在37°C形成高分子量聚集体，细胞内D2^T61I聚集较D2^WT更抗降解。Galectin-3斑点显示D2^T61I转染细胞基础溶酶体膜通透性（lysosomal membrane permeability, LMP）近4倍增加，LLOMe处理进一步放大；18月龄D2^T61I小鼠皮质galectin-3斑点面积增加。LAMP1⁺溶酶体空泡化在D2^T61I细胞中增加超过4倍。αSyn PFF清除实验中，D2^T61I细胞45小时后保留更多病理αSyn，而D2^WT较载体对照显著降低残余PFF。

CHCHD2^WT减轻而CHCHD2^T61I加剧年龄相关线粒体和溶酶体超微结构异常。TEM显示，老年WT小鼠线粒体嵴密度降低、形态变圆；老年D2^WT异常线粒体比例显著低于同龄WT；老年D2^T61I线粒体超微结构异常更严重。溶酶体方面，年轻WT溶酶体100%为健康“绿色”分类；老年WT约80%为“橙色”或“红色”；老年D2^WT保留更多健康溶酶体；D2^T61I无健康“绿色”溶酶体，并表现为电子致密、肿胀、不规则和脂滴积累。总体表明D2^WT保护线粒体-溶酶体轴，D2^T61I加剧年龄相关异常。

讨论总结与研究结论翻译：讨论指出，D2在LBD尤其是PD中关键，但D2^T61I对线粒体-溶酶体轴的广泛机制及D2^WT对年龄相关神经退变的保护作用此前不明。本研究显示人脑D2随年龄下降，可能增加LBD易感性；D2^WT小鼠对年龄相关退化具有神经保护作用，包括保留线粒体和溶酶体超微结构、降低神经炎症、增强多巴胺能神经元存活和减少不溶性蛋白积累；D2^T61I则加速脑老化，经线粒体-溶酶体轴加重轴突变性和认知缺陷。蛋白质组显示D2^WT降低不溶/可溶蛋白比，D2^T61I增加该比值；CLEAR通路下调，D2^T61I优先结合CTSB和CTSL并降低其水平和活性。人LBD皮质中D2与CTSB降低相关。CTSB和CTSL可降解αSyn，而CTSD不受D2^T61I影响，符合选择性机制。讨论提出，错误折叠D2^T61I在溶酶体积累可能破坏CTSB和CTSL运输与稳定性。TEM研究显示D2对溶酶体健康具有新作用。研究人员提出D2功能障碍可能起源于线粒体并传播至溶酶体，但因果关系仍待确定。治疗上，稳定D2表达、防止其错误折叠或破坏错误折叠D2与CTSB/CTSL互作，可能同时保护线粒体和溶酶体。结论翻译：这些发现，结合在人类LBD脑中观察到的CTSB和CHCHD2降低，确立CHCHD2是通过线粒体-溶酶体轴维持神经元对衰老和蛋白稳态崩溃韧性的关键调节因子。防止年龄相关的CHCHD2下降提供了在整个衰老过程中保护脑健康的治疗策略。总体，本研究确立D2是线粒体-溶酶体轴的关键调节因子，其功能障碍驱动脑衰老和LBD发病机制；D2^WT和D2^T61I小鼠的对比表型提供了机制见解和治疗机会。鉴于LBD中线粒体和溶酶体功能障碍汇聚，同时靶向两种细胞器的策略，如稳定D2表达、防止其错误折叠或破坏错误折叠D2与CTSB/CTSL互作，可能提供协同益处；这些方法可能通过解决蛋白稳态失败的根本原因，在衰老和LBD发病过程中同时保护线粒体和溶酶体。