《Cell Regeneration》：Early emergence of inter-lobar heterogeneity in mouse embryonic lung
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哺乳动物的肺被组织成解剖学上不同的叶，然而不同叶之间是否存在区域异质性仍知之甚少。本研究对假腺管期单个肺叶进行了全面的转录组学分析。比较分析揭示，一致的叶间差异主要发生在蛋白质编码基因水平。值得注意的是，左肺叶表现出免疫应答相关基因表达的富集以及早期一般毛细血
哺乳动物的肺被组织成解剖学上不同的叶，然而不同叶之间是否存在区域异质性仍知之甚少。本研究对假腺管期单个肺叶进行了全面的转录组学分析。比较分析揭示，一致的叶间差异主要发生在蛋白质编码基因水平。值得注意的是，左肺叶表现出免疫应答相关基因表达的富集以及早期一般毛细血管（gCap）内皮细胞的丰度增加，而右颅叶则优先表达与心室心肌形态发生相关的基因，并显示出较低的gCap富集程度。结合公开数据集与实验验证进一步确认了gCap细胞的异质性分布。综上所述，本研究的发现表明分子和细胞层面的叶间异质性在胚胎发育过程中已经出现，并强调了在理解肺发育及相关先天性疾病时考虑叶身份的重要性。
一、研究背景与科学问题
哺乳动物肺脏在解剖结构上分为多个独立的肺叶，但不同肺叶之间是否存在分子和细胞层面的异质性，长期以来缺乏系统性认识。已有临床观察显示，先天性肺部疾病（如支气管闭锁、先天性肺气道畸形）在不同肺叶中的发病率存在显著偏向性，提示肺叶的身份可能在疾病易感性中发挥重要作用。然而，这种叶偏好的病理基础是否源于胚胎发育阶段就已建立的固有异质性，目前尚不清楚。此外，心脏位于胸腔左侧，与右侧肺叶尤其是右颅叶紧密相邻，心肺器官间的空间协调发育机制也亟待阐明。因此，研究者旨在探索胚胎发育早期各肺叶是否已具备独特的分子和细胞特征，从而为理解肺叶特异性疾病的起源以及器官间相互作用的发育基础提供线索。
二、研究设计与主要结论
为解答上述问题，研究人员选取胚胎日15.5（E15.5）的小鼠肺脏作为研究对象——此时期处于假腺管期末尾，五叶结构（左叶、右颅叶、右中叶、右尾叶、右副叶）已清晰可辨，且支气管树基本定型。研究人员分别收集五个肺叶的组织样本，进行全转录组深度测序（包括mRNA和lncRNA），并结合公共单细胞转录组图谱与空间转录组数据，系统分析了各肺叶之间的分子差异和细胞组成偏好。主要结论如下：（1）各肺叶之间存在一致性的分子差异，主要体现于蛋白质编码基因层面；（2）左肺叶富集免疫应答相关基因，且早期一般毛细血管（gCap）内皮细胞丰度最高；（3）右颅叶富集心室心肌形态发生相关基因，且gCap细胞丰度最低；（4）这些差异在独立的空间转录组数据和RNAscope原位杂交实验中均得到验证。研究表明，肺叶间的分子和细胞异质性在胚胎发育早期即已建立，这一发现对于理解肺发育的区域调控机制及叶偏好性先天性疾病的发病机理具有重要意义。
三、关键技术方法
本研究采用了以下关键技术手段：（1）基于核糖体RNA（rRNA）去除的全转录组测序技术，对E15.5小鼠五个分离肺叶分别进行深度测序，每叶设三个生物学重复；（2）利用公共E15.5小鼠肺单细胞转录组数据集作为参考，采用BayesPrism算法对bulk RNA-seq数据进行细胞类型去卷积分析，建立了肺叶分辨率下的细胞组成表征框架（CCC-Lobe）；（3）整合公共空间转录组数据集，验证gCap标志基因Aplnr在各肺叶的表达分布模式；（4）采用RNAscope多重荧光原位杂交技术对Aplnr转录本进行组织水平的定量验证。小鼠品系包括野生型C57/BL6J和Nkx2-1-eGFP谱系示踪小鼠（购自Jackson Laboratory）。
四、研究结果分述
1. 小鼠肺发育形态追踪：利用Nkx2-1-eGFP谱系示踪小鼠，研究人员观察到从E9.5前肠腹侧出现局灶性GFP阳性内胚层憩室，到E12.0左右两肺原基形成初步分叶结构，直至E15.5五叶清晰可辨的完整发育过程，确认E15.5是研究最早潜在叶间异质性的最佳时期。
2. 肺叶深度转录组分析：通过对E15.5各肺叶进行rRNA去除全转录组测序，每叶检测到超过16000个mRNA和4600个lncRNA，生物学重复间高度一致（皮尔逊相关系数0.85~0.96）。主成分分析（PCA）显示，基于蛋白编码基因的前1000个高变基因可将各肺叶明显区分，而基于lncRNA则无法分离，表明叶间差异主要存在于编码基因层面。
3. 肺叶特异性转录组特征：差异表达基因分析鉴定出各肺叶特有的基因模块。左肺叶高表达55个与免疫系统过程正调控相关的基因；右颅叶高表达心室心肌组织形态发生相关基因，且排除心肌细胞污染后该特征仍然存在。qPCR和免疫荧光染色进一步验证了Aldh1a2、Rgs5、Gata4、Hoxb9等基因的叶特异性表达模式。
4. CCC-Lobe识别gCap细胞叶偏好性：通过整合单细胞参考图谱进行细胞类型去卷积，研究发现gCap内皮细胞在各肺叶间呈现显著的丰度差异：左叶丰度最高，右颅叶最低。利用公共空间转录组数据验证，gCap标志基因Aplnr的表达同样呈现左叶最高、右颅叶最低的分布模式。RNAscope染色进一步证实了这一结果，并在左叶内部观察到一定的前后轴（A-P）位置差异。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，左肺叶免疫相关基因的富集可能预示其具有内在的免疫应答倾向，这与近期报道的左叶对脂多糖刺激反应更强的现象相符。右颅叶中心肌形态发生基因的高表达，结合其与发育中心脏的解剖邻近性，提示可能存在共享的信号通路或多能心肺祖细胞的差异性分配。CCC-Lobe框架的建立揭示了以往被认为均匀分布的gCap细胞在胚胎期即存在显著的叶间变异，这可能影响后续血管发育、肺泡成熟以及损伤修复的区域性差异。研究还强调，成人肺的区域变异和多种肺疾病的叶偏好性可能至少部分源自胚胎期建立的叶特异性程序。结论部分总结：本研究的发现揭示了胚胎期肺叶间分子和细胞异质性的涌现，强调了在未来肺发育和疾病研究中考虑空间亚器官组织的重要性。
