基于外周血mRNA的预后模型预测mHSPC向mCRPC进展并鉴定SLC6A8为糖酵解促进型生物标志物

《Frontiers in Oncology》：Peripheral blood mRNA-based prognostic model for progression to metastatic castration-resistant prostate cancer and identification of SLC6A8 as a glycolysis-promoting biomarker

目的：约35%的转移性激素敏感性前列腺癌（metastatic hormone-sensitive prostate cancer, mHSPC）患者进展为转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC），这凸显了前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen, PSA）作为单一监测生物标志物的局限性。本研究旨在构建基于外周血mRNA的mCRPC进展预后模型，评估所鉴定生物标志物的预后价值，并探索表现最佳基因在前列腺癌细胞中的生物学作用。方法：分析单细胞转录组数据（GSE288878）以筛选mCRPC相关差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。对新诊断并接受一线雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy, ADT）为基础治疗的mHSPC患者开展前瞻性队列研究，采集其外周血样本进行转录组测序。GSE288878来源DEGs与该研究队列DEGs的交集定义为基因特征。将数据集按7:3随机分为开发集和验证集后，研究人员采用Elastic Net正则化Cox模型推导mCRPC无进展生存的预后模型。使用TCGA前列腺癌样本分析生物标志物基因与无进展生存期（progression-free survival, PFS）的关联。体外实验研究血液和癌组织中具有预后意义的基因的生物学作用。结果：鉴定出5个与mCRPC密切相关的候选基因（SLC25A39、GRB10、SELENBP1、SLC6A8和YBX3）。研究人员构建了预后模型，其在开发集中预测1年mCRPC无进展生存的曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.89（0.80–0.97），在验证集中为0.83（0.62–1.00）。研究人员鉴定出外周血中SLC6A8表达升高是进展为mCRPC的独立危险因素。在TCGA数据库中，前列腺癌组织中SLC6A8表达升高被鉴定为较短PFS的独立危险因素。药理学抑制SLC6A8显著抑制CRPC细胞增殖，降低糖酵解代谢物水平，并下调糖酵解相关基因表达。结论：该预后模型有效预测了接受一线治疗的mHSPC患者向mCRPC进展。SLC6A8可能作为预后生物标志物，并通过增强糖酵解促进前列腺癌进展。

研究背景：前列腺癌是男性常见恶性肿瘤，死亡率预计从2020年375,000例升至2040年约700,000例。mHSPC（metastatic hormone-sensitive prostate cancer，转移性激素敏感性前列腺癌）一线ADT（androgen deprivation therapy，雄激素剥夺治疗）联合ARPI（androgen receptor pathway inhibitor，雄激素受体通路抑制剂）可改善总生存期（overall survival, OS）和PFS，但约35%新诊断mHSPC患者5年内仍进展为mCRPC（metastatic castration-resistant prostate cancer，转移性去势抵抗性前列腺癌）。Awais Paracha et al.的队列研究发现约78%的mHSPC患者最终进展为mCRPC。Wenzel et al.发现23%仅影像学进展、35%仅生化进展；Tsutsumi et al.报道孤立影像学进展占20.1%（34/169），其中位OS较仅PSA（prostate-specific antigen，前列腺特异性抗原）升高者显著降低。因此，即使PSA未升高也需定期影像检查。Shao et al.利用三个GEO数据集建立铁死亡相关基因panel区分组织HSPC与CRPC，但肿瘤活检具有侵入性且不能连续追踪。AR-V7（androgen receptor splice variant 7，雄激素受体剪接变异体7）在CTC（circulating tumor cells，循环肿瘤细胞）中可预测阿比特龙/恩杂鲁胺耐药，但CTC稀少、分离困难且缺乏标准化。外周血mRNA模型具有无创、可动态监测和技术可行性。为此，研究人员分析GSE288878单细胞转录组筛选mCRPC相关基因，在四川肿瘤医院开展前瞻性mHSPC队列，采集外周血进行转录组测序，并利用TCGA（The Cancer Genome Atlas，癌症基因组图谱）前列腺癌样本评估基因与PFS关系，最后在体外研究预后基因的生物学作用。

关键技术方法：分析GSE288878单细胞转录组（GSM8777871为LNCaP_FGC/HSPC，GSM8777872为LNCaP_C4-2B/CRPC）；在四川肿瘤医院开展前瞻性队列，纳入新诊断mHSPC并接受一线ADT为基础治疗者，外周血转录组测序，147例完成随访；下载TCGA前列腺癌498例肿瘤样本；按7:3随机分开发集与验证集，采用Elastic Net正则化Cox（α=0.5，λ.1se）建模，并行列线图、tdAUC、校准曲线和DCA（decision curve analysis，决策曲线分析）；C4-2B细胞用Ompenaclid抑制SLC6A8，进行CCK-8、Annexin V-FITC/PI、转录组、WGCNA（weighted gene co-expression network analysis，加权基因共表达网络分析）、GO/KEGG、Western blot和非靶向代谢组分析。

研究结果：
3.1 单细胞转录组分析在GSE288878 CRPC模型中鉴定出两个肿瘤细胞簇：通过t-SNE和UMAP识别5个细胞簇（0–4）。GSM8777871来源HSPC中以簇1、2、4为主，GSM8777872来源mCRPC中以簇0、3为主。scMetabolism显示簇0和3主要贡献丙酸代谢、半乳糖代谢、糖酵解/糖异生和丙酮酸代谢。
3.2 鉴定出五个与mCRPC密切相关的DEGs：该前瞻队列147例完成随访，54例进展为mCRPC。外周血转录组显示mCRPC组较对照组有233个上调、293个下调基因。将研究队列DEGs与GSE288878 CRPC相关细胞特征基因取交集，得到SLC25A39、GRB10、SELENBP1、SLC6A8和YBX3共5个基因。
3.3 构建预后模型预测mHSPC向mCRPC转变：Elastic Net在λ.1se保留SLC25A39（0.0438）、SLC6A8（0.131）和YBX3（0.069）。多因素Cox模型中SLC25A39和SLC6A8为进展至mCRPC的独立预测因子。模型列线图C-index在开发集为0.849（95% CI：0.795–0.899），验证集为0.783（95% CI：0.688–0.880）。风险评分=0.460×SLC25A39+0.539×SLC6A8+0.374×YBX3，最佳截断值11.356。高风险组进展至mCRPC显著加速（HR=17.19，95% CI：6.55–45.11，P<0.0001），高风险组中位无mCRPC生存期466天，低风险组未达到。开发集1年mCRPC-free survival预测AUC为0.89（95% CI：0.80–0.97），验证集为0.83（95% CI：0.62–1.00）。校准曲线、DCA显示与LATITUDE相比，三基因模型在365天和545天具有更高特异性与IPCW校正准确度。
3.4 五个基因在前列腺癌组织中的预后价值评估：对TCGA所有前列腺癌患者肿瘤标本中五个交集基因进行逐步Cox回归，因TCGA未明确CRPC样本，采用PFS为终点，鉴定SLC6A8为PFS独立危险因素。
3.5 SLC6A8可能通过增强糖酵解促进CRPC细胞增殖：研究人员围绕SLC6A8进行体外药理学抑制研究。
3.5.1 Ompenaclid（一种SLC6A8抑制剂）抑制前列腺癌细胞增殖并促进凋亡：C4-2B细胞经Ompenaclid处理后，CCK-8显示48 h剂量依赖性活力抑制，Annexin V/PI流式显示0–450 μM范围内早期和晚期凋亡细胞增加。
3.5.2 450 μM Ompenaclid抑制前列腺癌细胞糖酵解：450 μM Ompenaclid处理C4-2B细胞48 h后转录组显示2,874个转录本上调、1,899个下调。WGCNA以β=10构建网络，得到9个模块；turquoise模块与Ompenaclid正相关（r=0.87，P=0.00106），blue模块负相关（r=?0.87，P=0.00106）。交集获得1,072个上调、638个下调基因。下调基因KEGG富集于TGF-beta信号通路、细胞周期、矿物质吸收、DNA复制、同源重组和糖酵解/糖异生，其中HK2（hexokinase 2，己糖激酶2）、PFKP（platelet isoform of phosphofructokinase，血小板型磷酸果糖激酶）和ALDH1B1（aldehyde dehydrogenase 1B1，乙醛脱氢酶1B1）富集于糖酵解/糖异生。Western blot显示Ompenaclid剂量依赖性下调SLC6A8、HK2、PFKP和ALDH1B1，450 μM抑制作用最强。非靶向代谢组显示两组分离，450 μM组629个代谢物升高、279个降低；还原型谷胱甘肽、乳酸、4-amino-7-chloroquinoline、3-chloro-L-tyrosine、L-gulose、丙酮酸、fructose-1,6-bisphosphate、glucose-6-phosphate、dulcitol和glucuronic acid下调，提示糖酵解受抑。MSEA富集显示差异代谢物显著富集于糖酵解/糖异生以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。

讨论部分总结：已有研究提示miRNA、TSG（tumor suppressor gene，抑癌基因）RB1、PTEN、TP53及外周血TMPRSS2-ERG等与CRPC或治疗耐药相关，但现有预后模型多受样本量、预测性能、回顾性设计、侵入性取材及治疗背景限制。研究人员认为，整合外周血基因表达与临床变量预测一线ADT为基础治疗mHSPC患者进展至mCRPC的模型尚缺乏。本研究基于5个交集基因构建模型，并指出全外周血bulk RNA测序不能明确转录本细胞来源，可能来自CTC、肿瘤来源细胞外囊泡、白细胞宿主反应或其混合。模型纳入5个候选基因及ECOG、Gleason评分、年龄、BMI等变量，经Elastic Net选出SLC25A39、SLC6A8和YBX3，列线图可估计365天和545天无mCRPC生存概率。研究人员提出该特征可能用于风险分层、治疗强化或降阶、临床试验富集等，但需前瞻验证。讨论还总结GRB10、SLC25A39、SELENBP1和SLC6A8的既往机制：SLC25A39参与线粒体谷胱甘肽转运和抑制铜死亡/铁死亡；SELENBP1作为甲硫醇氧化酶生成H₂S和H₂O₂，影响线粒体呼吸和AMPK；SLC6A8促进肌酸/磷酸肌酸摄取。TCGA分析显示SLC6A8高表达与较短PFS相关。Ompenaclid抗肿瘤效果在临床前模型中与SLC6A8通路消融可比。抑制SLC6A8后，C4-2B细胞增殖下降、凋亡增加，转录组和代谢组提示糖酵解受抑，HK2和PFKP直接调控糖酵解通量，ALDH1B1通过维持NAD⁺/NADH氧化还原平衡和解毒甲基乙二醛间接支持糖酵解。研究限制包括单中心、东亚人群、缺乏外部验证、药理抑制不能排除脱靶或确立遗传因果、TCGA发现过滤偏倚、仅C4-2B模型、白细胞亚群异质性、列线图仅适用于1年和1.5年、验证集较小。研究结论翻译：该预后模型对mCRPC无进展生存表现出良好的预测性能。SLC6A8可能作为一种潜在预后生物标志物，通过增强糖酵解代谢加速前列腺癌进展。