《Frontiers in Food Science and Technology》：Valorisation of Stichopus fusiformiossa body wall with high-pressure-induced endogenous proteolysis
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胶原富集的海洋生物质是蛋白质、肽和糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAG）的有前景来源，但其回收受致密细胞外基质（extracellular matrix, ECM）限制。本研究评估了高压处理（high-pressure processing
胶原富集的海洋生物质是蛋白质、肽和糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAG）的有前景来源，但其回收受致密细胞外基质（extracellular matrix, ECM）限制。本研究评估了高压处理（high-pressure processing, HPP）作为一种短时、非热策略，用于系统解组装 Stichopus fusiformiossa 的可触变性胶原组织（mutable collagenous tissue, MCT），并在不添加水或外源酶条件下促进内源性生物转化。体壁匀浆在100–600 MPa下处理10 min，并分析可回收蛋白酶活性、蛋白质溶解性、三氯乙酸（trichloroacetic acid, TCA）可溶性肽反应性物质、硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycans, sGAG）、残留基质结构、抗氧化能力以及胰α-淀粉酶抑制。HPP使蛋白酶活性从约6.3 U/g提高至36.9 U/g，可溶性蛋白从约46 mg/g提高至59 mg/g。TCA可溶性组分和可溶性糖胺聚糖在400 MPa时最高，表明压力依赖性基质动员。傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）和二维电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）显示残留不溶性胶原富集组分发生构象和组成变化，与蛋白质分配改变一致，而非明确的蛋白质组重塑。自由基清除能力提高至约10.2 μmol Trolox equivalents/g，酚类化合物提高至约7.1 mg gallic acid equivalents/g，胰α-淀粉酶抑制提高至约55%。总体而言，结果支持一种与HPP相关的机制，涉及基质重构、内源性蛋白酶可及性增加和功能成分动员，确立HPP作为一种有前景的胶原富集海参生物质非热增值化策略。
海参作为高值海洋食品和功能食品、营养品来源而受到关注，其富含胶原、硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycans, sGAG）、蛋白聚糖、糖蛋白、三萜糖苷和生物活性肽，并关联抗氧化、抗炎、抗凝、抗糖尿病和抗癌等生物活性。Stichopus fusiformiossa 是分布于东南亚海域的热带海参，体壁胶原含量高，具有治疗潜力。尽管其体壁是可回收胶原和明胶来源，且其他海参的全身体壁或胶原消化物可释放低分子量肽并表现体外抗氧化等活性，但回收这些化合物的主要障碍是体壁的分级组织。海参体壁主要由可触变性胶原组织（mutable collagenous tissue, MCT；棘皮动物特有的可动态调节力学性质的细胞外基质）构成，该组织由胶原纤维嵌入含蛋白聚糖、sGAG、糖蛋白和基质相关蛋白的高度有序基质中，结构完整性主要靠氢键、疏水相互作用和静电相互作用等弱非共价相互作用维持，从而限制常规加工下的提取性和生物利用度。海参组织还具有显著内源性蛋白水解系统；产后失控时，内源性丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、组织蛋白酶和其他水解酶导致自溶、结构崩解、肽释放和质地劣变；但在受控加工条件下，内源性蛋白水解可成为内在生物催化资源。传统提取依赖长时间热处理、酸提取、碱处理或酶水解，虽可提高提取率，但严重或延长处理可导致不可逆蛋白变性、蛋白氧化、聚集、热敏化合物降解、过度水解和功能性质下降；酸和胃蛋白酶法可有效回收部分胶原，但主要分离选定胶原组分，并未利用完整组织的内源酶能力。因此，需要更温和的策略选择性打开细胞外基质（extracellular matrix, ECM）。非热加工技术中，高压处理（high-pressure processing, HPP）尤其适用于胶原富集组织，因为静水压主要扰动维持蛋白三级和四级结构的非共价相互作用和水合平衡，通常保留共价肽键，并可诱导蛋白展开、构象重排、蛋白复合物解离和酶活改变。已有研究显示HPP增强多种食品体系的蛋白消化率、提取效率和生物活性肽生产。但关于HPP对海参体壁MCT及后续生物活性物释放的影响信息很少。基于海参ECM主要靠压力敏感的非共价相互作用稳定，研究人员提出HPP可能破坏胶原-蛋白聚糖关联，促进内源性蛋白水解和基质结合生物活性物释放。因此，本研究旨在不添加水的条件下，考察HPP对 Stichopus fusiformiossa 体壁匀浆结构、生化和功能性质的影响，重点阐明ECM去稳定、内源性蛋白水解、蛋白质组重塑、糖胺聚糖释放以及抗氧化和胰α-淀粉酶抑制活性增强之间的机制关系，为HPP作为非热海洋生物精炼技术增值化胶原富集海参生物质提供依据。
研究人员对体壁匀浆进行100–600 MPa、10 min处理，分析可回收蛋白酶活性、蛋白溶解、TCA可溶性肽反应性物质、sGAG、残留基质结构、抗氧化能力和胰α-淀粉酶抑制。研究结论支持一种HPP相关机制，即基质重构、内源性蛋白酶可及性增加和功能成分动员共同作用；其重要意义在于将HPP确立为有前景的胶原富集海参生物质非热增值化策略。
方法概括：样本为20只成熟 Stichopus fusiformiossa（15–20 cm，200±20 g），来自马来西亚 Perak 的 Pangkor Island，由 Centre of Marine and Coastal Studies (CEMACS), University Sains Malaysia 鉴定和全基因组测序；分两个独立生物批次，不同月份收获，每批10只。体壁匀浆在25 °C、100–600 MPa下处理10 min，处理后离心分离可溶和不溶组分。关键技术包括内源蛋白酶活性（酪蛋白底物）、可溶性蛋白、TCA可溶性寡肽、可溶性GAG和sGAG、残留不溶组分FTIR和2-DE、DPPH自由基清除、总酚含量（total phenolic content, TPC）、胰α-淀粉酶抑制及单因素方差分析。
3.1 压力诱导内源性蛋白水解（Pressure-induced endogenous proteolysis）：通过测定可回收内源蛋白酶活性、可溶性蛋白和TCA可溶性寡肽发现，蛋白酶活性从约6.3 U/g增至600 MPa约36.9 U/g，最大约5.9倍；可溶性蛋白从约46 mg/g增至58–59 mg/g，最大约29%；TCA可溶性部分最高约400 MPa，增加约32%。结论是HPP不直接切割共价肽键，而通过破坏非共价相互作用、部分展开、暴露切割位点、破坏细胞或溶酶体区室释放酶，增强酶介导蛋白水解；400 MPa代表基质打开、底物可及、内源酶活性和可溶性水解产物保留之间的平衡，500–600 MPa可能促进压力后重结合。
3.2 基质相关糖胺聚糖（Matrix-associated glycosaminoglycans）：通过可溶性GAG、sGAG的O-/N-聚糖比及GAG/collagen比分析发现，可溶性GAG从约12 mg/g增至400 MPa约33 mg/g；O-/N-聚糖比从约0.8增至400–600 MPa约1.5–1.6；GAG/collagen比随压力增加。结论是HPP促进ECM组分释放并广泛重塑胶原富集ECM，可能涉及压力驱动的非共价和水合变化以及内源酶切割非胶原基质蛋白和蛋白聚糖桥；但该比值不能直接证明选择性糖苷键切割，仍需组成或质谱确认。
3.3 傅里叶变换红外光谱分析（Fourier-transform infrared spectroscopy analysis）：通过残留不溶组分二阶导数FTIR和酰胺I区去卷积发现，酰胺I区（1600–1700 cm
-1）和碳水化合物区（约750–1300 cm
-1）存在压力依赖差异，1660 cm
-1对应胶原α-螺旋，860 cm
-1对应GAG；分子间β-折叠和β-折叠含量逐渐降低，无规卷曲和α-螺旋增加，500 MPa α-螺旋最高，600 MPa α-螺旋下降且β-折叠和无规卷曲部分增加。结论是HPP改变残留胶原富集不溶组分的构象组织、水化和分子间关联，与分子可及性增加和基质去稳定化一致；但光谱差异也可能反映压力依赖的组成分配。
3.4 压力处理基质蛋白电泳（Electrophoresis of pressure-treated matrix proteins）：通过2-DE分析残留不溶组分发现，未处理样品可分辨点较少，HPP在约15–40 kDa、pI 4–7改变点数和强度；200 MPa使约20和40 kDa、pI约6.6点最高，40 kDa从10,364.55增至38,864.57，20 kDa达31,470.59；更高压力出现弥散染色和垂直拖尾。结论是压力改变残留不溶蛋白分布和可检测性，可能反映解离、可提取性、蛋白水解片段、电荷状态或选择性保留；胶原富集ECM难溶解，2-DE解释受限。
3.5 抗氧化能力和胰α-淀粉酶抑制活性（Antioxidant capacity and pancreatic α-amylase inhibitory activity）：通过DPPH、TPC和胰α-淀粉酶抑制试验发现，自由基清除能力从约2.0增至500–600 MPa约10.0 μmol TE/g，TPC从约1.5增至约7.0 mg GAE/g，胰α-淀粉酶抑制从约20%增至约55%。结论是HPP增强功能活性；最高TCA可溶性肽和GAG在约400 MPa，而最高功能活性在500–600 MPa，说明功能不单由可溶性肽或GAG总量决定，更高压力可能改变释放物的组成、构象、分子大小或可及性，增加比活性；应归因于多种基质相关成分联合动员和转化。
讨论部分提出工作模型：HPP改变胶原-蛋白聚糖基质中的水合和非共价相互作用，增加内源蛋白酶可及性和可回收性，促进可溶性蛋白和GAG成分动员。与热加工不同，静水压主要扰动氢键、疏水相互作用和静电相互作用，较大程度保留共价肽键；海参MCT主要靠这些压力敏感相互作用稳定，因此ECM易发生压力诱导重排。同时，胶原-蛋白聚糖网络去稳定促进ECM组分释放。
研究结论翻译：高压处理在不添加水或外源酶条件下，诱导 Stichopus fusiformiossa 可触变性胶原组织发生压力依赖性结构、生物化学和功能转化。加压增加可回收内源蛋白酶活性、蛋白溶解、TCA可溶性肽反应性物质和GAG富集ECM成分动员。这些反应呈非线性，表明生物转化受基质打开、酶可及性、蛋白水解、溶解和压力后重结合之间的平衡控制。中间压力约300–400 MPa有利于可溶性肽反应性和含GAG组分回收，而500–600 MPa产生最高的可回收蛋白酶活性、自由基清除能力、酚类化合物和胰α-淀粉酶抑制。FTIR和2-DE支持残留胶原富集基质显著重组，尽管这些测量反映构象变化和压力依赖性组成分配。总体证据支持提出机制：HPP改变胶原-蛋白聚糖网络内非共价相互作用和水合，从而增加基质可及性，促进内源性蛋白水解转化和功能成分动员。非胶原基质蛋白和蛋白聚糖相关结构的切割可能促进胶原纤维解聚集，但该途径需要直接分子确认。然而，肽、GAG和其他还原化合物对观察到的功能活性的具体贡献仍未解决。需要进一步鉴定肽序列、分子量分布、GAG结构和酶动力学关系，以建立构效机制。总体而言，HPP显示作为短时、非热生物精炼策略的潜力，将ECM重构与海参组织内源酶能力耦合，为胶原富集海洋生物质增值化为功能性成分前体提供机制基础。
